4.1.5. Besiyeri Katkıları
Bazı besiyerleri doğrudan dehidre hazır formlarından veya formülasyonlarından hazırlanmakla beraber, bir kısım besiyerinde bütün bileşenler bir defada tartılıp sterilize edilemez. Böyle besiyerlerinde bileşenler ayrı ayrı hazırlanıp ayrı olarak sterilize edilir ve sonra diğer kısım ile karıştırılır. Bu tip besiyerlerinde besiyeri bileşenlerinin büyük çoğunluğunu oluşturan kısım bir defada hazırlanır ve bu kısım "bazal (= temel) besiyeri" olarak tanımlanır. Bazal besiyerinden ayrı olarak hazırlanan kısım ise "besiyeri katkısı" olarak adlandırılır.
Bazal besiyeri ile katkıların ayrı ayrı hazırlanıp sonradan karıştırılmaları kuşkusuz çeşitli zorunluklardan kaynaklanmaktadır.
a) Bazı bileşenler otoklavda sterilize edildiklerinde bozulurlar. Bunların en tipik örneği vitaminler, üre ve çeşitli şekerlerdir. Bunlar genellikle membran filitrasyon ile sterilize edilirler. Bazı besiyerlerinin bileşimine giren kan ise otoklavda sterilize edilemeyeceği gibi membran filitreden de geçirilemez. Sağlıklı hayvandan steril koşullarda alınan kanın steril olduğu kabul edilir. Bu tip katkılar sterilize edilmiş ve yeterince soğutulmuş besiyerine aseptik koşullarda ilave edilir.
b) Bazı besiyeri bileşenleri otoklavlama sırasında birbirlerinden olumsuz etkilenirler. Bunun ise en tipik örneği agar/asit etkileşimidir. Agar yüksek sıcaklıklarda yüksek asitlikten etkilenir ve jelleşme özelliğini yitirir. Bu nedenle asitli-agarlı besiyerlerinde asit ayrı, bazal besiyeri ayrı olarak hazırlanıp sterilize edilirler, bazal besiyeri ve asit yeteri kadar soğuduğunda (yaklaşık 50 oC) asit, bazal besiyerine aseptik koşullarda ilave edilir, karıştırılır ve petri kutularına dökülür.
Besiyeri katkılarının büyük bir çoğunluğu üretici firmalar tarafından steril katkılar olarak pazarlanmaktadır. Bir besiyerini formülasyondan hazırlamak ve dehidre hazır besiyeri kullanmak kıyaslamasında olduğu gibi bu tip katkıları laboratuvarda hazırlamak yerine endüstriyel ölçekte hazırlanmış steril katkılar kullanmak çok daha akılcıdır.
4.2. Cam Malzeme
Besiyeri hazırlamada kullanılacak cam malzemenin çok iyi bir şekilde yıkanmış ve durulanmış, besiyeri hazırlamada kullanılan kalitede sudan geçirilmiş ve kurutulmuş olması gerekmektedir. Besiyerinin hazırlanacağı cam malzemenin yeteri büyüklükte olması çoğu kere ihmal edilen, ancak önemli bir ayrıntıdır. Cam kapların hacmi yeterli bir karıştırma sağlanacak ölçüde olmalıdır. İdeal olarak, hazırlanacak besiyeri hacminin 2 misli hacimde cam kap kullanılmalıdır. Agarlı besiyerleri için besiyeri hacmi cam kap hacminin en fazla 3/4’ü olabilir.
4.3. Tartım
Tartımın yapılacağı terazinin duyarlılığı besiyerinin hazırlanış şekli ile doğrudan ilgilidir. Prensip olarak 0,01 gram duyarlıktaki terazi kullanımı yeterlidir. Formülasyondan giderek az miktarda hazırlanan besiyerlerinde bu duyarlık yeterli olmaz ise seyreltme tekniği ile 0,01 gram duyarlıktaki terazi kullanılabilir. Özellikle formülasyondan hazırlanarak çok düşük miktarlarda tartım yapılacak ise terazinin kalibrasyonuna özel önem verilmelidir. Kuşkusuz, laboratuvardaki tüm terazilerin kalibrasyonları belirli aralıklarla yapılmalıdır.
Tartım, doğrudan besiyerinin hazırlanacağı kaplarda yapılabileceği gibi tercihen özel tartım kapları da bu amaçla kullanılabilir. Hassas teraziye doğrudan erlen veya balonun konulması, daranın alınması ve besiyerinin bu kaba tartılmasının çeşitli sakıncaları vardır.
a) Terazi üzerinde gereksiz bir ağırlık vardır ve terazinin kalibrasyonu daha çabuk bozulur.
b) Hatalı olarak tartım sırasında gereğinden fazla miktarda madde koyuldu ise özellikle formülasyondan hazırlamalarda geri dönüş olanağı yoktur.
Tartım sırasında özellikle formülasyondan hazırlamalarda her madde için temiz spatül (= kaşık) kullanılması, besiyeri ve/veya besiyeri bileşenlerinin kapakları açıldıktan sonra gereksiz telaş ile hata yapmamaya özen gösterilerek elden geldiğince çabuk olarak tartımın bitirilmesi ve besiyeri kapağının sıkıca kapatılması, tartımlar sırasında besiyeri ve/veya besiyeri bileşenlerinin çok az da olsa toz bulutu oluşturmamasına özen gösterilmesi, eğer toz bulutu oluştu ise bunun kesinlikle solunulmaması, tartım sırasında besiyeri ve/veya besiyeri bileşenlerinin çıplak deriye ve özelikle göze temas etmemesinin sağlaması, eğer temas varsa bol su ile ivedilikle yıkanması önemli hususlardır. Bu tip ayrıntılara NaCl, sakkaroz gibi günlük hayatta sürekli iç içe olunan maddelerin de dahil edilmesi laboratuvar disiplini açısından son derece gereklidir.
4.4. Eritme
Tartılmış dehidre hazır besiyeri ve/veya besiyeri bileşenlerinin suda eritilmesinde aşağıdaki yol izlenmelidir.
Besiyeri hazırlanacak kaba gerekli suyun yarısı veya 1/3’ü konulur, tartımlar bu suyun içine yapılır, yeterli karıştırma sağlanır, sonra kalan su erlenin/balonun boğazında kalmış besiyeri ve/veya besiyeri bileşenlerini yıkayarak ilave edilir. Bu işlemin en büyük özelliği sıvı düzeyinin üzerinde kalabilecek ve sterilize olmayabileceği için kontaminasyonlara neden olabilecek besiyeri bileşenlerinin sıvı faza (besiyerine) geçirilmesidir.
Besiyerine ilave edilecek su miktarı çoğu kez hatalı ölçülür. Örneğin besiyeri hazırlanırken "dehidre hazır besiyerinden 23 gram 1 litre suda çözülüyor" ise bunun anlamı 23 gram dehidre besiyeri üzerine toplam 1 litre su ilave edilecek değildir. Erlen veya balona önce 1 litre su doldurulur, cam yazar kalemle su düzeyi hassas bir şekilde işaretlenir, suyun yarısından fazlası başka bir temiz kaba alınır, tartım yapılır ve besiyeri/besiyeri bileşenleri bu kapta eritilir, işaretli yere kadar su ilave edilir. Burada ilave edilecek toplam su hacmi 1 litreden daha az olacaktır. Az olan kısım, ise kuşkusuz, dehidre besiyeri/besiyeri bileşenlerinin hacmi kadardır.
Bazı dehidre besiyeri/besiyeri bileşenleri suda kolay erimezler. Bu gibi durumlarda besiyerinin 50 oC ‘a kadar ısıtılarak karıştırılması ve/veya suyun bu sıcaklıkta kullanılması erimeyi hızlandırır.
Eğer besiyeri sıvı ise (Broth/Buyyon) dehidre besiyeri/besiyeri bileşenleri tümüyle eridikten sonra tüplere, küçük hacimli erlenlere/balonlara dağıtılır veya doğrudan sterilize edilebilir.
Besiyeri bileşiminde agar varsa daha küçük hacimli kaplara dağıtmadan veya doğrudan sterilizasyondan önce agarın tam olarak erimesi için besiyerinin sürekli karıştırılarak kaynama sıcaklığına kadar getirilmesi, agar tam olarak eridikten sonra kabın doğrudan sterilizasyonu veya sürekli karıştırılarak ve 50 oC’da tutulmak kaydı ile küçük kaplara dağıtıldıktan sonra sterilizasyonu gerekir.
Özellikle az miktarlarda agar içeren besiyerlerinde ani kaynama sonunda taşmalar olabilir. Bunu önlemek için ısıtma sırasında sürekli karıştırma gerekir.
4.5. pH Ayarlama
İster ticari olarak hazırlanmış dehidre besiyeri hazırlama kataloglarında/ prospektüslerinde, ister bilimsel çalışmalara yönelik literatür bilgisinde olsun besiyeri pH ‘sından kasıt sterilizasyon sonu ve oda sıcaklığındaki (25 oC) pH ‘dır. Usulüne uygun olarak depolanmış ve raf ömrü bitmemiş ticari dehidre besiyerlerinde nötral su ve temiz cam malzeme kullanılması, besiyeri sterilizasyonunun sulandırmadan sonra vakit geçirmeden yapılması ile besiyeri pH ‘sında bir sorun çıkmaz.
Besiyeri pH ‘sının sterilizasyon öncesi ayarlanması yanlış olacaktır. Çünkü pH, sterilizasyon sonrasında az da olsa bir miktar değişir. Dolayısı ile pH ‘nın sterilizasyon öncesinde ayarlanması, sterilizasyon sonrasında yanlış pH elde edilmesine yol açacaktır.
Sterilizasyon sonrasında pH ayarlanması gerekli ise, aseptik koşullarda alınacak belirli bir hacimdeki besiyerinde titrasyon ile pH ayarlaması yapılır, basit orantı ile asıl kaptaki besiyerine ilave edilecek asit ya da alkali miktarı hesaplanır. Aksine bir belirtme yok ise genel bir kural olarak pH ayarlamasında filitre ile sterilize edilmiş 1 N NaOH ve 1 N HCl kullanılır. Sıvı besiyerinde pH ayarlaması kuşkusuz katı besiyerine göre çok daha kolaydır. Katı besiyerinde ise pH ölçüm ve ayarlama işleminin agarın jelleşme sıcaklığının üzerinde yapılması, pH metre kullanılıyor ise sıcaklık düzeltmesine dikkat edilmesi gereklidir.
4.6. Sterilizasyon
Kullanıma hazır steril besiyerleri ve katkılar dışında laboratuvarda hazırlanan tüm besiyerleri ile katkılar sterilize edilmelidir. Sterilizasyon, yaygın olarak ısıl işlem uygulaması ile ve zorunlu hallerde filitrasyon ile yapılır.
Işıl işlem, özel olarak aksine bir uyarı yoksa otoklavda ve 121 oC’da yapılır ve ısıl işlem uygulama süresi çoğunlukla 15 dakika olarak verilir.
Sterilizasyonun amacı dehidre besiyeri, besiyeri katkıları, cam malzeme, tartım ekipmanı, su ve pamuk/vidalı kapak vb. ‘den gelebilecek tüm mikroorganizmaları öldürmektir. Böylece besiyerinde gelişen mikroorganizma, çalışma özelliğine göre örnekten/ana kültürden gelmiş olacaktır. Bu mantık altında besiyerinin sterilizasyonunda elden geldiği ölçüde yüksek sıcaklık ve uzun süre uygulanması gerekir ve bu bakış açısı altında bu uygulama gereklidir. Ancak, 50 oC üzerindeki sıcaklıklarda besin maddeleri ve agarın jelleşme özelliği olumsuz etkilenir. Bu açıdan bakıldığında da elden geldiği ölçüde düşük sıcaklık ve kısa süre uygulaması bir anlamda zorunluktur. Kuşkusuz bu şekilde de sterilizasyon sağlanamaz ve özellikle kontrol amaçlı çalışmalarda sahte pozitif sonuçlar alınır (= false positive = örnekte olmadığı halde başta kontaminasyon olmak üzere çeşitli nedenlerle analizde pozitif sonuç alınması).
Bu çerçevede besiyerinin içinde bulunabilecek tüm mikroorganizmaları öldürmek, ancak besiyerine en az zarar verecek bir ısıl işlem normunun seçilmesi gerekir ki, bu norm 121 oC’da 15′ olarak ortaya çıkar.
Besiyerinin gereğinden yüksek sıcaklıkta ve/veya uzun sürede ısıl işleme maruz kalması yukarıda belirtildiği gibi besiyerinin özelliklerini yitirmesine yol açacak ve özellikle çeşitli kontrol çalışmalarında örnekte sahte negatif sonuçların alınmasına yol açacaktır (= false negative = örnekte olduğu halde besiyeri hataları nedeniyle aranılan mikroorganizmanın bulunamaması).
Otoklavda sterilizasyon normu çoğunlukla 121 oC’de 15 dakika olarak verilmekle beraber genel bir kural olarak daha yüksek sıcaklık ve daha kısa süre uygulaması mikroorganizmalar üzerinde daha fazla öldürücü ve kimyasallar üzerinde daha az zarar vericidir. Buna göre 126 oC’da 10 dakika ve 134 oC’da 3 dakika otoklavlama normları 121oC’de 15 dakika ısıl işlem normundan daha iyi sonuç vermektedir.
Otoklavlama sıcaklık ve süresi üzerindeki bir diğer yaklaşım öldürücü ısı uygulaması (= lethal heat treatment)’dır. Bu kavram 100 oC üzerindeki sıcaklıklarda kalma süresinin 121 oC ‘a çevrilmesidir. Örneğin 118 oC ‘da 1 dakika süre 121 oC ‘da 0,35 dakika beklemeye eşdeğerdir. Buna göre 121 oC ‘da 15 dakika ısıl işlem uygulaması bir anlam ifade etmemekte, bunun yerine "121 oC’da 15 dakika ısıl işlem uygulamasına eşdeğer ısıl işlem uygulaması" deyimi kullanılmalı, ayrıca, alışılagelmiş şekli ile 15 dakika olarak verilen süre yeniden analiz edilmelidir.
Isıl işlem normu üzerine öncelikle; a) Sterilize edilecek besiyerinin hacmi, b) Besiyerinde agar olup olmaması, c) Cam malzemenin cinsi etki eder. Bu faktörler aşağıda sırasıyla kısaca özetlenmiştir.
a) 15 dakika süre standart test tüplerinden 500 mL hacime kadar geçerlidir. 500 mL hacim için 20 dakika ; 1 litre hacim için 25′ süre kullanılmalıdır. Prensip olarak, aksine ve özel olarak belirtilmemiş ise 1 litre hacim otoklavda sterilizasyon için üst sınırdır. Bu hacimden daha fazla hacimlerin sterilizasyonu için 30 dakika ve daha uzun süreler kullanılmalıdır.
Yapılan bir araştırmada aynı et kalınlığına sahip cam kaplar kullanılmış ve besiyeri sıcaklığının otoklavda 121 oC ‘a çıkma süresi 500 mL için 18 dakika, 1 litre için 22 dakika, 2 litre için 27 dakika ve 5 litre için 37 dakika olarak bulunmuştur. Bu durumda 5 litrelik bir kapta sterilizasyon yapılırken otoklav sıcaklığı 121 oC ‘a çıktığında sadece 15 dakika beklenirse besiyeri sıcaklığı henüz 121 oC ‘a ulaşmamış olacaktır. Bir diğer deyiş ile otoklav içi sıcaklık ile otoklavdaki besiyeri sıcaklığı aynı değildir ve otoklav sıcaklığı olarak ölçülen değer otoklavdaki atmosferin sıcaklığını göstermektedir.
b) Besiyeri bileşiminde agar varsa, ısı iletimi agarsız olanlara göre daha geç/zor olacaktır. Agar ısıyı zayıf ileten bir bileşiktir. Dolayısı ile agarlı besiyeri hacimle ilişkili olarak agarsızlara göre 2-5-10 dakika gibi daha uzun süre ile sterilize edilmelidir. Yapılan bir araştırmada ince çeperli bir kapta 500 mL agarlı besiyerinin aynı hacimde normal çeperli bir kaptaki saf suya göre 121 oC ‘a 6 dakika daha geç ulaştığı belirlenmiştir.
c) Besiyerinin sterilize edileceği cam kabın et kalınlığı ısı iletiminde önemli bir faktördür. Doğal olarak ince et kalınlığına sahip standart erlen ve balonlar ısıyı normal bir şekilde iletirken kalın et duvarlı özel şişelerde ilave sterilizasyon sürelerine gerek duyulur.
Otoklavda sterilizasyonda dikkate alınması gereken en önemli husus "toplam ısı girişi" kavramıdır. Bu kavram 50 oC üzerindeki sıcaklık/süre alanıdır. Şekil 1’de 4 farklı otoklavlama örneğinde toplam ısı girişi gösterilmiştir.
Besiyerlerinin sterilizasyonunda kullanılacak otoklavlar farklı şekillerde olabilir. En basit otoklavlar ev tipi düdüklü tencere benzeri olup bunlara sıcaklık ve basınç göstergeleri ilave edilmiştir. Standart otoklavlar laboratuvarlarda sıklıkla kullanılır. Bunlar yatık ve dik tiplerde olabilir. Daha gelişmiş otoklavlarda otoklav içindeki hava önce vakumla boşaltılır. Böylece otoklavlama sırasında kabinde hava kalması önlenir. Bunlarda, işlem sonrası çabuk soğutma için su ceketleri de bulunabilmektedir. Su ceketleri, soğutma amaçlı su spreylerinden farklı olarak kabin dışından soğutma sağlarlar.
Tüm bu bilgiler çerçevesinde otoklavda sterilizasyon için dikkat edilmesi gereken hususlar aşağıda özetlenmiştir.
– Farklı hacımlar beraberce otoklavlanmamalıdır. Otoklavda 10 mL hacimde sıvı besiyeri ile 1 litre hacimde agarlı besiyerinin beraberce sterilize edileceği ortalama bir ısıl işlem uygulama süresi aramak tümüyle yanlış olacaktır.
– 1 litrelik hacim otoklavlama için üst sınırdır. Daha büyük hacimler mümkün ise daha küçük hacimlere bölünmelidir.
– Otoklav çabuk ısınmalı, çabuk soğutulmalıdır. Laboratuvarda çok yapılan bir HATA, besiyeri hazırlama işlemlerine sabah başlanılması, otoklavın öğleye doğru açılması, 121 oC ‘a ulaştıktan sonra 15-20 dakika beklenip otoklavın kapatılması ve yemeğe gidilmesi, yemek dönüşü ise yeteri kadar soğumuş otoklavın açılarak besiyerlerinin otoklavdan çıkarılmasıdır. Bu uygulama ile yukarıda şekil 1c ve 1d’de gösterildiği gibi gereksiz fazla toplam ısı girişi olmaktadır.
– Besiyerinin hacmi, kullanılan cam kapların et kalınlığı, besiyerinin agarlı olup olmamasına göre otoklavlama süresi belirlenmelidir.
– Besiyeri hazırlandıktan sonra ivedilikle sterilize edilmelidir. Dehidre besiyeri ve/veya besiyeri bileşenleri ile cam kaplar, su, tartım ekipmanı vb materyalde mikroorganizma bulunması doğaldır. Bu mikroorganizmalar hazırlanmış besiyerinde hızla gelişerek besiyerinde başta pH değişmesi olmak üzere bir seri olumsuzluklar meydana getirirler.
– Vidalı kapaklı tüpler ve/veya şişeler içinde besiyeri otoklavlanacağında, işlem öncesi kapaklar gevşek kapatılarak sterilizasyon sırasında tüp ve/veya şişelerden havanın çıkması sağlanır. Kapaklar, sterilizasyon sonrasında tam kapatılır. Ancak, kapaklar çok sıcak iken kapatılırsa bu kez vakum oluşur ve kapak açıldığında besiyeri havadan kontamine olabilir.
Bazı besiyerleri otoklavda sterilize edilmez. Ticari olarak hazırlanmış dehidre besiyerlerinde eğer otoklavda sterilizasyon yapılmayacak ise bu durum açıkça belirtilir. Örneğin Salmonella geliştirilmesinde kullanılan BSA, HEA, SSA, koliform bakteri aranmasında kullanılan VRBA besiyerleri OTOKLAVLANMAZ. Bazı besiyerleri ise otoklavda 121 oC’da 15 dakikadan daha düşük sıcaklık ve/veya sürelerde tutulur. Enterobacter Enrichment Broth ve Litmus Milk (121 oC’da 5 dakika), DEV Nutrient Jelatin (115 oC’da 10 dakika) bu tip besiyerlerine örnektir. DEV Dextrose Broth 115 oC’da 20 dakika sterilize edilen bir başka örnektir.
Besiyerinin otoklavlanmaması yeterli bir ayrıntı değildir. Bu besiyerleri herhangi bir ışıl işleme maruz kalacaklar ise bu normlar bilinmelidir. Dehidre besiyeri üreten firmaların ürünlerinde/kataloglarında bu normlar her zaman açık bir şekilde verilmemektedir. Örneğin "sürekli karıştırarak kaynama noktasına getirilir" ya da "otoklavlanmaz" gibi ibarelere rastlanılabilmektedir. Bu gibi durumlarda sadece bir kaç saniye kaynatmak muhtemelen ilk akla gelecek çözüm olacaktır. Bununla birlikte, Selenite Cystine Broth gibi bazı besiyerlerinde eritmek için dahi 60 oC sıcaklığın geçirilmemesi gerektiği dikkate alınırsa bu tip belirsizliklerde elden geldiğince filitrasyon yoluna gidilmesi, filitrasyon mümkün değilse olabildiğince düşük sıcaklık derecelerinde sterilizasyona gidilmesi ve sıcaklığın seçiminde ortamda bulunabilecek hedef mikroorganizmanın öldürülmesi esas alınmalıdır.
Dehidre besiyeri üreten farklı firmalar aynı bileşimdeki besiyeri için farklı ısıl işlem normu verebilmektedirler. Örneğin DeMan Rogosa Sharp (MRS) Broth ve MRS Agar besiyeri için Merck 118 oC’da 15′; Oxoid, BBL, LabM 121 oC’da 15 dakika sterilizasyon önermektedir.
Koliform grubun kültürel sayımında çok yaygın olarak kullanılan Violet Red Bile (VRB) Agar besiyerinin sterilizasyonunda ise bu çerçevede tam bir karmaşa vardır. Aşağıda dehidre besiyeri üreten 5 ayrı firmanın VRB Agar besiyeri için hazırlama şekli verilmiştir.
BBL: Sürekli karıştırarak 1 dakika kaynatın, soğutun, hemen kullanın. Alternatif olarak 121 oC’da 15′ sterilize edilebilir.
Difco: 2 dakikadan fazla kaynatmayın. Otoklavlamayın.
LabM: Sürekli karıştırarak kaynatın. Otoklav gerekli değil.
Merck: Serbest buharda 30′ tutun. Otoklavlamayın.
Oxoid: Kaynama noktasına getirin. İlave sterilizasyon gerekli ve istenir bir işlem değildir.
Bu gibi örnekler çoğaltılabilir. Kuşkusuz hangi firmanın ürünü kullanılıyor ise o firmanın prospektüsünde gösterildiği şekilde besiyerini hazırlamak bir anlamda zorunluktur.
Otoklavda sterilizasyonun ne denli sağlandığı sterilizasyon indikatörleri ile belirli sıklıklarla kontrol edilmelidir. Hatta otoklav bantlarının her otoklavlama için kullanılması önerilir. Sterilizasyon kontrolünde en sık kullanılan indikatörler biyolojik indikatörler (spor suspansiyonları) ve çeşitli kimyasal indikatörlerdir.
Bu tip indikatörlerin kullanılamaması halinde alışılagelmiş bir sterilizasyon kontrol yöntemi şahit besiyeri kullanmaktır. İnoküle edilmemiş bir besiyerinin inoküle edilmişler ile birlikte inkübe edilmesi sterilizasyonun ne denli sağlandığını gösterebilir. Bu konuda yapılabilecek en büyük HATA agarlı besiyeri olan petri kutularının tümünün bir gece boyunca (12 saat) veya 24 saat inkübatörde bırakılarak sterilite testi yapılmasıdır. Böyle bir uygulamada besiyerinde gereğinden fazla kuruma olacak ve ekim sonrası istenilen performans alınamayacaktır.
4.7. Sterilizasyon Sonrası İşlemler
4.7.1. Katkıların İlavesi
Sıvı besiyeri için herhangi bir sorun yoktur. Besiyeri ve katkı maddeleri oda sıcaklığında aseptik olarak karıştırılır.
Agarlı besiyerlerinde ise agarın henüz sıvı formda kalabildiği yeterince düşük bir sıcaklıkta katkı maddeleri ilave edilir. Bu ilavede aşağıdaki konulara dikkat edilmesi gerekir.
a) Katkı maddesi asla soğuk olmamalı, oda sıcaklığı hatta 30-35 oC civarında olmalıdır. Böylelikle bazal (agarlı) besiyerlerinde katkının ilavesi ile ani soğumalar ve yerel jelleşmeler önlenmiş olur.
b) Katkı ilave edilecek agarlı (bazal) besiyeri içine sterilizasyon öncesi manyetik taş (= balık) atılarak bununla beraber sterilize edilmesi, katkı ilavesi sırasında ve/veya sonrasında manyetik karıştırıcıda hafifçe karıştırarak katkının besiyeri içinde yeknesak olarak dağılması sağlanabilir. Bu işlemde karıştırma anafor oluşturacak kadar hızlı yapılırsa ani soğumalara ve/veya besiyeri içinde hava kabarcığı oluşumuna neden olur. Anafor oluşturacak kadar hızlı karıştırma yapılmış ise ve petri kutularına döküm ile jelleşme sonrasında hava kabarcıkları görülmüyor ise karıştırma işleminin, dolayısıyla katkı ilavesinin agarlı besiyeri çok sıcak iken yapıldığı anlaşılır.
c) Kanlı agar (= Blood Agar) yapımında defibrine kan, sterilize edilmiş ve 45 oC ‘a kadar soğutulmuş bazal besiyerine ilave edilip iyice karıştırılarak kanın havalanması sağlanır. Bu amaçla geniş ağızlı erlen kullanılmalıdır. Yeteri kadar havalanmış kanlı agar besiyeri petri kutularına dökülüp jelleştikten sonra kiraz renginde iken, az karıştırılmışta bu renk menekşedir.
4.7.2. Agarlı Besiyerlerinin Petri Kutularına Dökülmesi
Otoklav veya daha geniş tarifi ile ısıl işlem ile sterilizasyon sonrası agarlı besiyerleri çoğunlukla petri kutularına dökülerek kullanılır. Agarlı besiyerlerinin diğer kullanılış şekilleri arasında tüplerde yatık veya dik agar, erlende yatık agar, Rouxe şişelerinde kullanım vs sayılabilir. Sayılan bu diğer kullanım şekillerinde agarlı besiyeri genellikle anılan kaplarda sterilize edilir. Ancak, agarlı besiyerlerinin petri kutularında sterilize edilmeleri uygulanan bir şekil değildir. Agarlı besiyerleri her zaman erlen/balon/şişelerde sterilize edilir ve sterilizasyon sonrası steril petri kutularına aseptik koşularda dökülür. Petri kutularında agarlı besiyeri kalınlığı 5 mm kadar olmalıdır.
Agarlı besiyerinin otoklavlama sonrası petri kutusuna hangi sıcaklıkta döküleceği konusunda pek çok yanlış uygulamaya rastlanmaktadır. Agarlı besiyeri kullanımında tartışmasız en doğru uygulama otoklav sonrası besiyerinin hızla 50 oC ‘a soğutulması ve bu sıcaklıkta petri kutularına dökülmesidir. Eğer petri kutusunda "dökme yöntemi kültürel sayım" amacıyla önceden ilave edilmiş örnek varsa dökme sıcaklığı 45 oC olmalıdır. Bu uygulamada dikkat edilmesi gereken bir diğer husus petri kutusunda bulunan mikroorganizmaları olası termal şok zararlarından korumak için petrilerin oda sıcaklığında tutulması gerekliliğidir.
Agarlı besiyerinin petri kutularına dökülmesi aşamasında yapılan en önemli 2 HATA aşağıda verilmiştir.
HATA a) Petri kutularına döküm sırasında kontaminasyondan korunmak için agarlı besiyeri elden geldiğince sıcak (80 oC) dökülmektedir. Bunun HATA olma nedeni aşırı kondensasyon ve besiyeri yüzeyinin geç kurumasıdır.
HATA b) Öğle yemek saati vb nedenlerle besiyerinin sterilizasyon sonrası otoklavda bırakılmasının zararlarına yukarıda değinilmiş idi. Benzer bir HATA agarlı besiyeri için döküm öncesi 50 oC sıcak su banyosunda uzun süreli bekletme ile yapılır. 50 oC ‘da dahi uzun süreli beklemeler agarın jelleşme özelliğinde kayıplara neden olur. 48 oC ‘da 4 saat beklemek izin verilebilecek en yüksek sıcaklık/süre kombinasyonudur.
4.7.3. Kurutma
Petri kutularına dökülüş agarlı besiyerlerinde yüzeyin ıslak olması çoğunlukla istenmez. Tersine olarak aşırı kurumalar da olumsuz sonuç verir.
Dökümden sonra besiyeri yüzeyinin kurutulması gerektiğinde Şekil 2’de gösterildiği gibi 2 farklı yöntem uygulanabilir.
Şekil 2. Petri Kutularında Agarlı Besiyeri Yüzeyinin Kurutulması
a) Çabuk kurutma b) Güvenli kurutma
Şekil 2a ‘da petri kutularında agarlı besiyeri yüzeyinin çabuk kurutma yöntemi verilmiştir. Şekilden de görüleceği gibi bu yöntemde kuruma çabuk, ancak kontaminasyon riski yüksektir. Şekil 2b ‘de gösterilen kurutma yöntemi ise tersine olarak geç kuruma ancak düşük kontaminasyon riski sağlar.
Kurutma, mutlaka temiz ve serbest hava akımı olmayan yerlerde yapılmalıdır. Steril hava akımı ile çalışan aşılama kabini (= Laminar air flow), sterilizasyon amacıyla kullanılan ve kurutma sırasında çalıştırılmayan etüvler (= sterilizasyon fırını = sterilizatör), UV lamba ile sterilize edilen kabinler kurutma için kontaminasyon olmaması açısından en güvenilir yerler arasındadır. Kuru hava sterilizatörlerinde kurutma sırasında sıcaklığın 50 oC ‘da tutulması hızlı bir kuruma sağlar. Ancak bu uygulamada besiyerinin aşırı kuruma riski vardır.
4.7.4. Agarlı Besiyerinin Yeniden Eritilmesi
Sterilize edildikten sonra soğutulmuş jelleşmiş agarlı besiyerlerinin çeşitli nedenlerle yeniden eritilmeleri gerekebilir. Burada ilk akla gelen 2 neden, istem dışı olarak agarlı besiyerinin jelleşmesi ve besiyerinin her an kullanılabilecek şekilde elde hazır tutulmasıdır.
Sebep ne olursa olsun jelleşmiş bir agarlı besiyerinin yeniden eritilmesi için 90 oC ‘da 1-2 dakika tutma zorunluğu vardır. Bu uygulama ise toplam ısı girişi açısından önerilmez. Bununla beraber pek çok laboratuvarda çeşitli besiyerleri arasında agarlı besiyerleri de sterilize edildikten sonra steril şekilde belirli bir süre depolanır. Bu uygulama daha çok rutin kontrol yapan laboratuvarlarda örneğin 1 hafta boyunca kullanılacak besiyerlerini 1 kerede hazırlamak amacıyla yapılır.
Kuşkusuz, katkı ilave edilmiş agarlı besiyerinin tekrar eritilmesi söz konusu değildir. Benzer şekilde yüksek sıcaklığa duyarlı olan besiyerinde yeniden eritme önerilmez. Hatta bazı agarlı besiyerlerinin prospektüslerinde yeniden eritilmemesi gerektiği uyarılır. Prensip olarak katkı ilave edilmiş ve/veya otoklavda sterilize edilmeyen agarlı besiyerleri yeniden eritilmez.
Agarlı besiyerinin eritilmesi gerektiğinde elden geldiği ölçüde az ısı girişinin sağlanması, bu amaçla su banyosunda 85-90 oC ‘da tutularak erimenin gerçekleştirilmesi ancak, kesinlikle OTOKLAVLANMAMASI gerekir. Agarlı besiyerlerinin eritilmesinde mikro dalga fırınlar başarıyla kullanılmaktadır.
Agarlı besiyerinin sadece 1 kez yeniden eritme şansı olduğu, bunun dahi besiyerine yeteri kadar zarar verdiği, 1’den daha fazla yeniden eritmelerin besiyerine kabul edilemeyecek düzeyde zarar vereceği gözden uzak tutulmamalıdır.
belgesi-790
