Serum Protein Analizleri

Categories: Biyokimya

       Proteinler azot, karbon,oksijenin yani sira fosfat,kukurt ve diger bazi elementleri de tasiyan organik bilesiklerdir.Hucrenin kuru agirliginin ¾ unu olustururlar.Enzimatik aktivite, savunma,tasima,depolama,mekanik hareket,mekanik destek,biyolojik sinyal,buyume ve farklilasma iletimi gibi fonksiyonlarinin yani sira yapisal bilesen olarak da davranirlar.

       Proteinler,amino asit polimerleridir.Protein yapisinda yer alan aminoasitlerin belirli sayi ve sirada dizilisi ve daha sonra uc boyutlu yapinin kazanilmasi ile fonksiyonel protein meydangelir.Bilesim ve cozunurluklerine gore basit (albumin,globilin,histon,protaminler) ve bilesik (glikoprotein,mukoprotein,nukleoprotein,fosfoprotein,kromoprotein,lipoprotein ve metalloproteinler)olmak uzere iki gruba ayrilabildigi gibi sekillerine gore de globuler (cozulebilir,sekillenebilir proteinler;albumin gibi) ve fibriler(sert,kirilgan,cozunemeyen proteinler;kollajen,keratin gibi) olarak siniflamak mumkundur.

       Proteinlerde amino asitleri bir arada tutan veya belirli sekillenmelerini saglayan kuvvetler ya kuvvetli (peptit baglari,disulfit kopruleri) ya da zayif (hidrojen baglari,vander Waals kuvvetleri,molekuller arasiitme ve cekmeler) karekterde olabilir.

       Proteinlerin gosterecegi aktivite uc boyutlu yapinin bir sonucudur.Uc boyutlu yapi ise uc veya dort kademeli yapilasma sureci (primer,sekonder,tersiyer,kuaterner yapi) sonunda kazanilir.Uc boyutlu yapinin bozulmasina denaturasyon denir.Denature protein kendisinden beklenen fonksiyonu yerine getiremez.Denaturasyon,cesitli faktorlere(isi,pH,agir metal tuzlari,radyasyon isinlari gibi ) bagli olarak meydana gelir.Bu olay sirasinda primer yapi haric diger butun yapilar bozulur.

Serum total proteininin fizyolojik degeri;

         Yeni dogmus      % 5.0 – 6.5 gr
         Sut cocugu          % 5.5 – 7.0 gr
         6 – 12 aylar         % 6.5 – 7.5 gr
         Yetiskin              % 6.5 – 8.5 gr

       Pratik nedenlerden kliniklerde kan proteinlerinin incelenmesi genellikle serumda yapilir.Bu durumda fibrinojen uzaklastirilmis oldugundan serum tum protein degeri plazmaya gore yaklasik %0.2 – 0.4 gr daha dusuktur.Kan alinirken yapilan venoz staz total protein degerini onemli olcude yukseltir.Ayrica vazomotor olaylarda tum protein miktarini etkiler. Bu nedenle normal degerin tayini icin kan sabahleyin alinmalidir.

       Kan proteinlerinin incelenmesi bize protein metabolizmasini yansitmaz.Bunun icin protein yikim urunlerinin idrarda birkac defa bakilmasina,protein dengesinin ortaya konulmasina gerek vardir.Hastaliklardan bircogu serum protein fraksiyonlarinda degisikliklere sebeb olsada pek azinda serum total proteininde artis veya azalis olur.Bu durum hem proteinlerin genis olan normal degerine (% 6.5 – 8.5 gr) hem de hastalik durumunda kural olarak birkac globilin fraksiyonunun artmasi halinde albuminin buna uygun olarak azalmasi ile ve sonuc olarak total proteinin degismemesinden kaynaklanmaktadir.Normal degerin genis bir alana yayilmasina karsilik serum total protein degerinin cok dar bir sapma degeri vardir.

Hipoproteinemi Nedenleri

1-Protein kaybi ile olan hipoproteinemi nedenleri:
a-Barsaktan protein kaybi:

Menetrier sendromu ,mide polipi,ulseroz gastrit,coliak spru,gluten enteropatisi,kolitis ulseroza,mide-barsak ve safra yollari karsinomlari,barsak stenozu,Hirschsprung hastaligi,jejonum divertikulu ve hemitiazis.

b-Bobrekten protein kaybi:

Nefrozlar, glemerulonefrit,bobrek amiloidozu.

c-Deri yolu ile protein kaybi:

Yaniklar,deskuamasyonla seyreden deri hastaliklari(psoriazis),dermatit.

d-Vucut bosluklarindan eksuda yada transudanin uzaklastirilmasi ile olusan protein kaybi:

2-Kotu beslenme,uzun sure i.v beslenme.

3-Diyare,kronik zehirlenmeler(benzen,karbontetraklorur,fosfor),tedavi gormemis pernisiyoz anemi,ayarlanmamis diyabetes mellitus,kalp yetmezligi,hipertroidizm,gebelik toksemileri.

4-Karaciger yetmezligi;siroz,kanser.

Hiperproteinemi Nedenleri

1-Multpl Myelom
2-Makroglobilinemi
3-Cesitli tropik hastaliklar(lepra,kala-azar)

Relatif Hiperproteinemiler

1-Sindirim kanalindan su kaybi(diare,kusma)
2-Bobrek yolu ile su kaybi(bobrek yetmezliginde poliuri,tuz kaybettiren nefrit,diuretik tedavi)
3-Su aliniminin kisitlanmasi

I-KALITATIF PROTEIN ANALIZLERI

       Kalitatatif protein analizlerinin temelinde,protein denaturasyonu ile uc boyutlu yapinin bozularak proteinlerin cokmeleri veya uygun bir renklendirici ajanla renk olusturmalari esasi yatmaktadir.kalitatif analizler iki grup altinda totlanabilir.

1-Renk Olusumuna Dayanan Testler:

       Proteinlerdeki bazi gruplarin kimyasal ayiraclarla birlesip renkli kompleksler olusturmasi seklinde ortaya cikar.Proteinlerin aminoasit icerigi farkli oldugundan olusacak renk ve siddeti degisik olacaktir.

a)-Biuret Deneyi:

       En karekteristik renk reaksiyonudur.Bu deneyde,proteinler kuvvetli alkali ortamda Bakir sufat(CuSO4) ile pembemsi mor renkli bir kompleks olustururlar.Bunun icin iki veya daha fazla peptit bagi bulunmasi gerekir.

b)-Millon Deneyi:

       Reaksiyon protein molekulundeki hidroksifenil grubunun varligindan kaynaklanir ve tirozin,fenol,timol gibi 3,3 pozisyonunda fonksiyonel grubu bozulmamis fenolik grup tasiyan her bilesik ayni reaksiyonu verir.

c)-Ksantoprotein Reaksiyonu:

       Bu reaksiyon protein molekulunde bulunan fenil gruplarinin varliginda gerceklesmekte olup nitrikasit,nitro bilesiklerini olusturmaktadir

d)-Ninhidrin Reaksiyonu:

       Amino asitlerin kalitatif ve kantitatif tayininde kullanilir.Aminoasitlerin amino grubu oksidan ajan ninhidrin ile tepkimeye girerek mavi mor renkli bilesik olusur.Butun alfa aminoasitler bu reaksiyonu verir.Prolin ve hidroksiprolin sari,asparajin kahverengi urun verir.

2-Proteinlerin Cokmesine (presipitasyon) Dayanan Testler:

       Bu tur testler,bir proteinin agir metal tuzlari (HgCI2,AgNO3,ZnSO4,Ba(OH)2 ),asit ve bazlar,organik cozuculer,isi, aktif deterjanlar,basinc,Uvradyasyon,ure cozeltisi gibi denature edici ajan veya faktorlerle uc boyutlu yapinin bozulmasina dayanir.

a)-Agir Metal tuzlari ile Cokturme:

i-Somogy Yontemi (Cinkosulfat +Baryumhidroksit Yontemi):

       1 ml serum 5 ml suya konur buna %4,75 gr lik Ba(OH)2 cozeltisinden 2ml eklenir,karistirilir.Daha sonra %5grlik ZnSO4 cozeltisinden 2ml katilir karistirilir,kisa bir sure kendi haline birakilir ve suzgec kagidindan suzulur.

ii-Tungustik Asit Yontemi:

       1ml serum alinir uzerine 0,5 ml Na-tungustatin sudaki %10 luk cozeltisinden ve 8ml distile su konur calkalanarak karistirilir.Sonra uzerine H2SO4(0,33Mlik veya 0,67N lik) den 1ml konur calkalanir.10 dk beklenir ve kuru bir suzgec kagidindan suzulur,berrak bir suzuntu elde edilir.

b)-Asit ile koagulasyon(Trikloro Asetik Asit-TCA-Yontemi )

       1ml serum alinir,uzerine %20lik TCA cozeltisinden 1ml ilave edilir.Hafif bir bulaniklik gozlenir.Bu tup kuvvetli bir sekilde calkalanir,20dk beklenir,tupun dibinde kuvvetli bir cokelek ustunde berrak bir sivi ayrilir.Cokelme kuvvetli asit TCA dan dolayidir.

c)-Alkolle Presipitasyon

d)-Isi ile Koagulasyon

II-KANTITATIF PROTEIN ANALIZLERI

       Kantitatif protein analizleri,proteinlerin renklendirme,cokturme,boya baglama,bulaniklik olusturma,isaretleme gibi islemlerle dayanir.

1-Azot analizi:

       Serumda bulunan azotlu maddeler,proteinler ve non-protein nitrojen(NPN) olarak adlandirilan ure,kreatinin,urikasit,aminoasit gibi maddelerdir.Azot miktarini degerlendirmek icin kullanilan metodlarin basinda KJEDAHL yontemi gelir.Bu yontemde biyolojik materyalde bulunan ve azot iceren maddeler amonyum sulfat((NH4)2SO4) haline cevrilir; daha sonra degisik metodlarla (Kjeldah.neslerizasyon,gazometrik,iodometrik metodlar) buradaki azot miktari belirlenir.

2-Renk Olusumuna Dayanan Testler

a)-Biuret Yontemi:*

       Proteinlerdeki peptit baglarinin bazik ortamda Cu+2 iyonlari ile menekse renkli bakir –peptid bagi-protein kompleksi olusturmalari ve bu kompleksin absorbansinin 540 nm de spektrofotometrik olarak degerlendirilmesi prensibine dayanir.Amino asitler ve dipeptitler bu reaksiyonu vermez.Yaygin olarak kullanilan bir yontemdir.

Reaktifler

       1-Serum fizyolojik(%0,9luk NaCI )

       2-Biuret Solusyonu: 3gr CuSO.4H2O tartip 100ml suda cozulur.Ayri bir kapta 12grC4H4KnaO6.H2O(sodyum potasyum tartarat) tartilir ve bir miktar suda cozulur.Her iki cozelti birbirine karistirilir.2lt lik bir balon jojeye aktarilir,uzerine %10luk NaOH den 600 mlt yavas yavas devamli olarak calkalanarak ilave edilir,iyice karistirilir.2gr KI(potasyum iyodur)ilave edilir ve 2ltye saf su ile tamamlanir.

       3-%10luk NaOH 1000ml



Deneyin Calisilmasi

       Kor icin 1,Standarticin1,calisilacak numune sayisi kadar da numuneler icin tup alinir.Uzerleri K,S,N1,N2,N3.,……….. yazilir.



Kor


Standart


Numuneler

Distile Su


100?L


–


–

Standart


–


100 ?L


–

Serum


–


–


100 ?L

Serum Fizyolojik


1 mL


1 mL


1 mL

Biuret Reaktifi


6 mL


6 mL


6 mL

Karistirilir,oda isisinda 15 dk bekletilir.540 nm dalgaboyunda kore karsi okunur.

Standart hazirlanmasi:%30luk bovin serum albuminden 0,1ml alip serum fizyolojik ile 0,6ml ye tamamlanirHazirlanan standardin konsantrasyonu %5liktir.

                                                                              N.absorbansi

Hesaplanmasi:Numune Konsantrasyonu(%gr)= ¾¾¾¾¾¾   C S.konsantrasyonu(%5)

                                                                              S.absorbansi

b)-Folin-Lowry Yontemi:

       Protein once bazik ortamda biuret ayraci ile reaksiyona sokulur,daha sonra Folin ciocalteu ayraci (fosfo tungunstik asit ve fosfomolibdik asit karisimi) katilir.Olusan bakir-peptit bagi –protein kompleksi ve aromatik aminoasitler(tirozin,triptofan gibi) folin ayracini indirgeyerek mavi renkli bir kompleks olusturur.Bu kompleks spektrofotometrik olarak olculur.

3-Fizikokimyasal Yontemler:

a)-Isigi Kirma Indeksi(Refraktometri):

       Biyolojik sivilarda bulunan kati maddelerin konsantrasyonu isigi kirma indeksi ile dogru orantilidir.Serumda bulunan kati maddelerin buyuk cogunlugu proteinler oldugundan serumun olculen kirma indeksinin proteinlerle dogru orantili oldugu kabul edilir.

b)-Ultraviole Spektrofotometrisi:

       Proteinler 200-225 ve 280 nm dalgaboyundaki ultraviyole isigi absorblarlar.200-220 nm deki absorbsiyon peptit baglarindan,280 nm deki absorbsiyon ise fenilalanin,tirozin ve triptofan amino asitlerinden gelir.Bu metodda hicbir kimyasal isleme tabi tutulmadan cozeltideki protein miktari olculur.

4-Iyonik Cokturme

       Proteinlerin anyonik veya katyonik formda bulunmasi soz konusudur.Katyonik formdaki proteinler anyonik cokturuculerle,anyonik formdakiler ise katyonik cokturuculerle cokturulerek homojen bir suspansiyon elde edilir.Bu suspansiyon turbidometrik veya nefolometrik olarak degerlendirilir.

5-Boya Baglama Yontemleri:

       Proteinlerin boyar maddeleri baglama ozelliginden yararlanarak analiz yapilmasidir.Ozellikle Albumin tayininde metil oranj ,brom krezol yesili gibi boyalar kullanilir.

6-Immunokimyasal Yontemler:

       ELISA,RIA ile isaretlenmis antikor kullanilarak olusan protein-antikor kompleksinin subrat ilavesi ile urune donusturerek ,olusan urunun spektrofotometrik yada fulorometrik olcumune dayanir.

belgesi-476