Parasitoloji Labaratuvarı

1) DIŞKI MUAYENELERİ:

Güvenlik:

Dışkı örneği ile çalışan laboratuvarlarda
potansiyel olarak bulunan tehlikeler şunlardır.
Parazit yumurtası veya kistleri (cysts) yutmak,
enfektif larvaların deriden geçişi yada dışkıdaki
veya diğer biyolojik sıvılardaki paraziter olmayan
enfeksiyöz ajanlarca enfekte olmak. Bu riskin oranı
genel laboratuvar temizlik ve çalışma şartları
uygulanarak azaltılabilir.
Laboratuvarda çalışırken dikkat edilmesi gereken
genel kuralları şu şekilde sıralayabiliriz.

1-Laboratuarda örnek incelerken (çalışırken)
laboratuvar önlüğü ve lastik eldiven giymek.
2-Gerekli durumlarda biyolojik güvenlik kabini
kullanılmalı (filtreli özel kabinler).

3-Çalışma ortamında yiyecek yenmemeli, sigara, çay
v.b. şeyler içilmemeli, makyaj yapılmamalı, kontak
lens takma-çıkarma-düzeltme yapılmamalıdır.

4- Çalışma sahası daima temiz ve düzenli tutulmalıdır.
Akan, dökülen yada etrafa sıçrayan her türlü örnek
yada maddeler hemen temizlenmelidir. Saha günde bir
kez dekontaminasyon (bulaşıklardan uzaklaştırma-
temizlik) işlemine tabi tutulmalıdır.

5-Ellerde bulunan kesik, yırtık v.b. yaralar ve
ezikler yara bandı veya pansuman malzemeleri ile
kapatılmalıdır.

6-Eğer keskin maddeler (bistüri ucu, iğne v.b.)
kullanılmış ise bunlar hemen özel atık kutularına
yerleştirilmelidir. Ortada bırakmak yada normal çöp
kovalarına atmak sakıncalıdır.

7-Eldivenler çıkartılıp uygun biyolojik atık çöp
kutularına atılır. Eller temizce yıkanır.

Bu güvenlik kuralları mutlaka uygulanmalıdır. Hatta
dışkı örneği belli fiksatifler (tespit ediciler) ve
prezervatifler (koruyucular) içinde dahi olsa yukarda
ki işlemler yapılmalıdır. Örneğin formalin
(formaldehit) içerisinde tespit edilmis dışkıdaki bazı
kalın kabuklu parazit yumurtalarının, kistlerin
(cysts) yada oocystslerin (ookists) ölmesi için günler-
haftalar gerekebilir. Ascaris lumbricoides’in
yumurtası formalin içerisinde gelişmesine devam
edebilir ve infektif duruma gelebilir.

Dışkı Örneği Toplama:

1.Dışkı kuru ve sızdırmaz kaplar içerisine
toplanmalıdır. Bu sırada diğer maddeler (idrar,
toprak, saman v.s.) ile kontaminasyonu (bulaşması) engellenmelidir.

2.Dışkının kıvamı içeriği hakkında bilgi verebilir.
Şekilli dışkıda parazitlerin daha çok kistik (cysts)
formları bulunurken, sıvı (sulu) dışkı kıvamına doğru
gidildikçe kistik form azalır ancak trophozoit
(tırofozoid) formları daha çok görülür. İncelemeye
başlarken bu durum unutulmamalıdır.
3.Taze dışkı ya hemen incelenmeli yada daha sonra
incelenecekse zaman geçirmeden prezervatifler
(koruyucular) içerisine konulmalıdır. Eğer
prezervatifler hemen kullanılamıyorsa buzdolabında
kısa süreli saklama yapılabilir. Ancak bu dışkı sadece
antijen testleri için uygun olacaktır.

4.Örnekler mümkün olan en kısa sürede prezervatiflere
konulmalıdır. Eğer ticari bir prezervatif kullanılıyor
ise bu ürünün kullanım bilgilerine uyulmalıdır. Eğer
ticari koruyucular kullanılmıyor ise; örnekler ikiye
ayrılmalı ve uygun kaplarda iki ayrı prezervatif
içerisine konulmalıdır. Örneğin: % 10’luk formalin ve
PVA (polivinil alkol) kullanılabilir. Bir hacim dışkı
üç hacim prezervatif ile karıştırılmalıdır.

5. Toplanan örneğin prezervatif ile tam olarak
karıştığından emin olunmalıdır. Şekilli dışkılarında
iyice dağılıp, parçalandığından emin olunmalıdır.

6. Örnek konulan kapların iyice kapatıldığından
emin olunmalıdır. Kapaklar parafilm yada benzeri
maddeler ile yeniden sarılmalı ve kaplar plastik
torbalara konulmalıdır.

7. Belli ilaçlar dışkı içeriğini değiştirebilir.
Bu durumdaki dışkılar muayene için alınmamalıdır.
Örnek, herhangi bir ilaç veya madde verilmeden önce
alınmalıdır. Yada örnek ilaç etkisi geçtikten sonra
toplanabilir. Bu ilaçlara; antiacid, kaolin, mineral
yağ veya diğer yağlı maddeler, emilmeyen anti-diyare
preperatları, baryum yada bizmut (7-10 gün beklenmeli
atılmaları için), antimikrobiyel ilaçlar (2-3 hafta)
ve safra kesesi boyaları (3 hafta).

8. Eğer ilk incelemede sonuç negatif çıkarsa
örnek alınması tekrarlanabilir. Mümkünse en az üç
örnek 2-3 gün ara ile alınıp incelenmelidir.

Örneklerin İncelenmesi:

Dışkı örnekleri taze olarak yada prezervatiflerde
korunmuş olarak incelenebilir.

Taze dışkının incelenmesi:
Taze dışkı
incelemesi hareketli trophozoitlerin görülebilmesi
açısından gereklidir. Ancak bu örnek toplandıktan
sonraki ilk yarım saat (30 dakika) içerisinde
incelenmelidir. Sıvı (ishal-diyare-diarhoic) dışkılar
daha fazla trophozoit içerirler. Yumuşak kıvamlı
dışkılar hem cysts hemde trophozoit formlarını
barındırabilmektedir. Bu nedenle ilk bir saat
içerisinde incelenmelidir. Eğer bu süre aşılırsa sonuç
güvenli olmaz. Çünkü bu süre sonrasında trophozoitler

parçalanıp dağılmaktadır. Daha kıvamlı (şekilli)
dışkılar da trophozoit bulunma oranı çok azdır. Bu
durumdaki örnekler bir süre saklanabilirler. Eğer
gerekirse buzdolabında korunabilirler. Parazitolojik
muayenelerde kullanılacak dışkılar kesinlikle
dondurulmazlar. Dondurulan dışkılardaki parazit
yumurta ve oocystsleri parçalanırlar.

Prezervatifli Dışkının İncelenmesi:

Dışkı
inceleme yukarda belirtilen süreler içerisinde
yapılamayacaksa , örneği prezervatiflerde saklamak
gerekir. Bu amaç için kullanılabilen çeşitli
prezervatifler vardır. En çok kullanılan
prezervatifler %10’luk formalin, Polivinil Alkol gibi
preparatlardır.

Formalin (% 10) ve PVA diğer prezervatiflere göre daha
fazla avantaj sağladığı için bu iki fiksatif daha çok
kullanılır. Örneklerin ikiye ayrılarak bu iki
prezervatiflede tespit edilmesi tavsiye edilmektedir
(bir hacim dışkı ile üç hacim prezervatif
karıştırılmalıdır). Prezervatife konulmuş örnekler
birkaç ay korunabilir.

Formalinde Tespitli Örnekler:
örnekler direk olarak incelemeye alınabilirler
(ıslak yuva, immunoassay,
kromotrop boyama) yada yoğunlaştırma (konsantre etme)
işlemi yapılarak daha sonraki testlerde kullanıma
hazır hale getirilebilir.

Yoğunlaştırma İşlemleri: Bu işlem parazit veya
yumurtalarını dışkıdan ayırma işlemleridir. Böylece az
sayıda bulunan paraziter durumları da teşhis etme
şansı artmış olur.
Sedimentasyon (çöktürme) ve flotasyon (yüzdürme)
yöntemleri olarak iki kısma ayrılır.

Flotation (flotasyon) tekniği:
Bu yöntemde genellikle sofra tuzu (NaCl), şeker yada
çinko sülfat (zinc sulfate) solusyonları kullanılır.
Bu sıvılar organizmadan daha yüksek spesifik
graviteye (özgül yoğunluğu) sahip oldukları için
paraziter yapılar yüzüp yukarı çıkarken çoğu dışkı
kalıntıları dibe çöker. Bu işlemin asıl avantajı
sedimentasyon tekniğine göre daha temiz inceleme
maddesi elde edilir. Dezavantajı ise bazı yumurta yada
kistler (cysts) bu solusyonlar içerisinde
büzüşebilirler yada bazı parazit yumurtaları
yüzmeyebilirler. Bu durumda teşhis zorlaşabilir.

Sedimentation(sedimentasyon) tekniği:
Çöktürme işleminde spesifik gravitesi (özgül
yağunluğu) paraziter organizmalardan daha düşük olan
solusyonlar kullanılır. Böylece bu organizmalar
sedimentin içerisinde yoğunlaştırılmış olurlar.
Sedimentasyon tekniği genelde çok kullanılır çünkü
kullanımı ve hazırlanışı kolaydır ve teknik hata yapma
ihtimali çok azdır. Formalin-etil asetat (formalin-
ethyl acetate) ile çöktürme işlemi çok kullanılan bir
yöntemdir. Genel olarak kullanılan prezervatiflerle
toplanmış örneklere de uygulanabilir.

Formalin-Ethyl Acetate Sedimentasyon Konsantrasyonu

1. Örneği iyice karıştırın.

2. Dışkı örneğinin yaklaşık 5 ml’sini süzün (çay
süzgeci yada mikro elek)

3. Fizyolojik tuzlu su yada % 10’luk formalini
süzgeçte kalan kalıntılara dökerek tekrar süzün ve bu
şekilde 15 ml deney tüpünü doldurun. Distile su
kullanılması tavsiye edilmez. Çünkü eğer örnekte
Blastocystsis hominis varsa bu parazit deforme
olabilir yada parçalanabilir.

4. Örneği 10 dakika santrifüj et (1000 rpm-
dakikada devir yada 500g)

5. Üstte kalan sıvıyı dikkatlice dök bu sırada
çöküntü bozulmamalı. Sıvı dökülürken iyice
sızdırmaktan kaçınılmalı. Son kısımda paraziter
maddeler olabilir.

6. Çöküntü üzerine 10 ml %10’luk formalin eklenip
tekrar homojen hale getirilir.

7. Üzerine 4 ml etil asetat (ethyl acetate) ileve
edilir ve deney tüpü kapatılıp içerik iyice
karıştırılır.

8. Tüp tekrar 10 dakika santrifüj edilir (1000
rpm-500g)

9. Tüpün üst kısmında (tepe) biriken dışkı
kalıntıları bir çubukla tüpten ayrılır. Üst kısımdaki
sıvılar dikkatlice boşaltılır.

10. ucuna pamuk sarılmış bir çubuk ile tüp
kenarındaki kalıntılar temizlenebilir.

11. Bir kaç damla % 10’luk formalin ilave edilerek
dipteki sediment sulandırılır ve örnek istenilen deney
metodu için kullanıma hazırdır.

PVA İçerisinde Tespit Edilmiş Örnekler:

Kalıcı Trikrom boyamalar için genellikle PVA
prezervatif olarak kullanılır. Boyama öncesinde şu
işlemler yapılır.

1. Dışkı örneğinin iyice karışmış olmasına dikkat
edilir.

2. Dışkı örneğinden 2-3 damla (dışkı yoğunluğuna
bağlı) alınarak sürme preperat hazırlanır.

3. Preperat ısı ile tespit edilir (60oC – 5
dakika) yada normal oda ısısında tamamen kurutulur.

4. Insure that the specimen is well mixed.

Preperat trikrom boyama yapılabileceği gibi daha
sonraki boyamalar için bir kaç ay preperat koruyucu
kutularda saklanabilir.

Örneklerin Başka Yerlere Nakli:

Bazı durumlarda bölgenizde parazitoloji laboratuvarı
bulunmayabilir. Bu durumlarda dışkı örnekleri başka
bölgelerdeki laboratuvarlara gönderilmesi gerekebilir.
Bu durumlarda dikkat edilmesi gereken hususlar
aşağıdadır.

Prezervatifsiz Dışkı Örneklerinin Nakli:

Bazı durumlarda laboratuvarlar şüphenelinen
patojenleri izole edebilmek için prezervatif
kullanılmamış örnekler isteyebilirler (örneğin
microsporidia kültürü yapılacak dışkılar). Böylesi
durumlarda örnekler hemen temiz bir kaba konulmalı ve
gönderilene kadar buzdolabında saklanmalıdır. Örnekler
alındıktan sonra en kısa sürede (ortalama 8-12 saat),
soğuk taşıma şartlarında taşınarak ulaştırılmalıdır.
Kullanılan kaplar sızdırmaz olmalı ve örnek ile ilgili
tüm bilgiler kap üzerine yazılmalı yada not olarak
yanına ilave edilmelidir.

Prezervatifli Örneklerin Nakli:

Prezervatifli örneklerin nakil kuralları
prezervatifsiz örneklerinki ile aynıdır. Sadece
buzdolabında saklamaya ve soğuk taşımaya gerek yoktur.

Paketleme:

Dışkı örnekleri sızıntıları engelleyecek şekilde
paketlenmelidir. Paketleme kaba işlemlere dayanıklı
malzemeden secilmeli ancak depolama, paletli-kızaklı
sistemlerde hareket edebilir olmalıdır. Örnek hacmine
göre iki farklı paketleme yöntemi kullanılabilir.

Hacmi 50 ml’ye kadar olan örnekler:

1. Nakledilecek mateteryal su sızdırmaz tüp veya
kaba konulmalıdır (buna birinci nakil kutusu yada
birinci kutu-kap, denilebilir).

2. Birinci kap, su sızdırmaz, dayanıklı bir
kutuya konulur (ikinci nakil kabı-kutusu)

3. Birden fazla birinci nakil kutusu, ikinci
nakil kutusuna yerleştirilebilir ancak toplam hacim 50
ml’yi geçmemelidir.

4. Soğuk kaynağı olan buz paketi v.s. yanında,
sızma ihtimaline karşı emici maddeler de kutuya
konulmalıdır. Bu maddeler kutu içindeki tüm hacmi
emebilecek özellikte olmalıdır. Emiciler, parçalı
maddelerden, talaş v.s. olmamalıdır.

5. Daha sonra bu kutular asıl nakil kutusuna
(koli, özel taşıma kutusu v.b.) yerleştirilir.

6. Asıl nakil kutusu üzerinde “Biyolojik
Madde”, “Tıbbi Malzeme” gibi uygun uyarıcı yazılar
mutlaka rahatca görülebilecek yerlere konulmalıdır.

Hacmi 50 ml’den fazla olan örnekler:

Büyük hacimli örnekler paketlenirken yukardaki
kuralların hepsi uygulanmalıdır. Bunlara ilaveten
aşagıdaki kurallarda yerine getirilmelidir.

1. Birinci ve ikinci taşıma kutuları arasına ve
her yönde şok emici maddeler mutlaka ilave
edilmelidir. Bu işlemden sonra asıl taşıma kutusuna
yerleştirilmelidir.

2. Birinci taşıma paketi 1000 ml’den (bir
litreden) fazla örnek taşımamalıdır. Birden fazla
birinci taşıma kutusu toplam hacimleri 1000
ml’geçmemek üzere ikinci taşıma kutusuna
yerleştirilebilir.

3. Asıl taşıma kutusu birden fazla ikinci taşıma
kutusu taşıyacaksa toplam hacim 4000 ml’yi (4 litre)
geçmemelidir.

Boyama:

Kalıcı boyama yöntemleri ile boyanmış yayma (sürme)
prepreperatlar laboratuvarlara avantaj sağlarlar. Bu
sayede hem kalıcı olarak kayıt tutulabilir hemde
ihtiyaç olduğunda örnekler yeniden incelenebilir.
Ayrıca farklı organizma morfolojileri ile
karşılaşıldığında yada teşhis zorluğu ile
karşılaşıldığında bu preperatlar referans laboratuvarlara gönderilebilirler. Yukarda sayılan
nedenler yüzünden her paraziter kontrole gelen dışkı örneğinden en az bir adet sürme preperatın kalıcı
boyamalar ile boyanması tavsiya edilir.

Modifiya Asit-fast Boyama :

Bu boyama metodu İsospora, Crptosporidium, Cyclospora
gibi coccidian parazitlrin teşhisinde kullanışlıdır.
Trikrom boyamaya göre teşhiste avantaj sağlar.
Modifiye asit-fast boyamada, Ziehl-Neelsen boyamada
olduğu gibi boyama maddelerini ısıtmaya da gerek
yoktur.

Örnek:

Taze yada formalindeki dışkı örneği çökeltme ile
konsantre edildikten sonra kullanılabilir. Diğer
klinik örneklerde (duedonum sıvıları, safra yada
akciğer sıvıları (balgam, bronş yıkantısı , biyopsi)
yine bu boyama ile boyanarak incelenebilir.

Reagentlar (Boyamada kullanılacak Solusyonlar):

Asit-Fast boyamada aşağıdaki solusyonlar hazır
olmalıdır.

1. Absolute Methanol (Saf Metanol)

2. Asit Alkol

10 ml Sülfirik Asit + 90 ml Absolute ethanol. Oda
ısısında depolanmalıdır.

3. Kinyoun Carbol fuchsin (Karbol Fuksin)

(ticari olarak satın alınabilir)

4. Malachite green %3 (Malahit yeşili)

Malahit yeşilinin 3 gramını 100 ml distile suda çözdür
ve oda ısısında depo et.

Boyama İşlemi

1. Dışkı örneğinin sedimentinden 1-2 damla bir
lam üzerine damlatılıp yayılır. Yayılan dışkı çok
kalın olmamalıdır. Bu preperat 60°C’de tamamen
kurutulur.

2. Preperat absolut metanol içerisinde 30 saniye
tespit edilir.

3. Karbol fuksin ile bir dakika boyanır. Distile
su ile hafifce yıkanır ve suyu süzdürülür.

4. Asit alkol kullanılarak iki dakika boyama
nötürleştirilir (İstenmeyen boya miktarı
uzaklaştırılır.)

5. Malahit yeşili (Malachite green) ile karşı
boyama yapın. Distile su ile hafifce durulayın ve suyu
süzdürün.

6. Preperatı sıcak havada (60°C) beş dakika
kurutun. uygun bir lamel ile preperat kapatılabilir.
İstenilen bölgeler örtülerek incelemeye hazır hale
getirilir.

7. Preperat mikroskop altında düşük yada yüksek
büyütmeler ile incelenir. Organizmaların morfolojik
detaylarını görmek için immersiyon (mineral) yağ
kullanılabilir.

Kalite Kontrolü:

Bir adet kontrol preperatı boyamanın ne denli başarılı
olduğunu konrol için örnek ile beraber boyanmalıdır.
Bu amaç için genellikle Cryptosporidium (% 10 ‘luk
formalinde tespit edilmiş) Kullanılır.
Cryptosporidiumlar kırmızımsı-pembe renkte boyanırken
arkaplan yeşil boyanmış olmalıdır.

Kromotrop Boyama (Chromotrope) İşlemi:

Bu boyama yöntemi trikrom (trichrome) bazı boyama
maddeleri kullanılarak CDC tarafından geliştirilmiştir
(Centre for Disease Control and Prevention-USA). Bu
metod ile microsporidia sporlarını tespit edebilmek
için kullanılmaktadır.

Örnek:

Formalin ( %10) içerisinde korunmakta olan dışkı
örneğinden 10 µl alınarak sürme preparat hazırlanır.
Preperat ısı ile kurutulup tespit edilir (60°C’de 5-10 dakika).

Reagents (Solusyonlar):

1. Absolute methanol

2. Chromotrope Stain )kromotrop boya)

Chromotrope 2r (Kromotrop
2r) 6.00 g

Fast green )Hızlı
yeşil)
0.15 g

Phosphotungstic acid (fosfotungistik
asit) 0.70 g

Glacial acetic acid (Glasiyal asetik
asit) 3.00 ml

Bu maddeleri karıştırıp yarım saat (30 dakika) beklet
ve 100 ml distile su ilave et. Her ay taze olarak
kullanmak üzere yenisini hazırla.

3. Acid alcohol: (asit alkol)

90% ethanol 995.5 ml

Glacial acetic acid 4.5 ml

4. 95% ethanol

5. 100% ethanol

6. Xylene (Ksilen)

Boyama İşlemi:

1. Örneği (sürme preperat) absolute methanol
içinde 5 dakika tespit et.

2. Kromotrop boya içerisine koyup 90 dakika
boyama yap

3. Boyamayı nötürleştir , asit alkol içerisinde 1-
3 saniye.

4. Örneği % 95’lik ethanol içerisine batırarak
asit alkolü durula.

5. İki % 100’lük ethanol kabı hazırla ve örneği
içerisine koyarak (sıra ile) üçer dakika beklet.

6. İki ayrı ksilen (xylene yada hemo-de) kabı hazırla ve ayrı ayrı 10 dakika burada beklet.

7. preperatı süzdür ve kurutup üzerini uygun
lamel ile kapatıp tespit et. İmmersiyon oil yöntemi
ile en az 200 mikroskop sahasını incele.

Kalite Kontrol:

Formalinde ( % 19) prezerve edilmiş microsporidialı
olduğu bilinen bir örnekte, incelenecek örnek ile
boyanırsa boyama kalitesini kontrol etmek mümkün
olabilir. Microsporidi sporlarının duvarı pembemsi-
kırmızı renkte boyanır ve çapları yaklaşık 1µm
çapındadırlar. Her 10 preperat boyamasından sonra tüm
solusyonlar yenilenmelidir. Boyama esnasında durulama
ve kurutma işlemleri tam yapılmalıdır.
Microsporidiaları tespit edebilmek için 100X’lük
büyütme kullanılmalıdır. Pazitif sonuçlar ikinci bir
eksper tarafından doğrulatılmasında yarar vardır.

Modifiye Safranin Tekniği (Sıcak Metod)

Cyclospora, Cryptosporidia ve Isospora için kullanılır:

Klinik örneklerinde çoğunlukla Cyclospora oocystleri
tespitinde Kinyoun’un modifiye acid-fast boyaması
(soğuk boyama) kullanılır. Ancak, asit-fast boyama
tekniğinde oocystsler farklı derecelerde boyanırlar.
Boyanmış, yarım boyanmış yada boyanmamış oocystsler
aynı örnekte görülebilir. Bu durum yanlış teşhislere
yol açabilmektedir. Modifiye safranin tekniğinde daha
üniform (aynı tipte) oocystsler elde edilir. Boyaalr
ısıtıcılar yardımı ile kaynama noktalarına kadar
ısıtılırlar.

Örnekler:

Concentrated sediment of fresh or formalin-preserved
stool may be used. Other types of clinical specimens
such as duodenal fluid may also be stained.

Solusyonlar:

1. Asit Alkol (% 3 HCl/Methanol)

Hidroklorik asidi (3 ml) yavaşca absolute metanol (97
ml) içerisine ilave edip ağzı sıkıca kapalı kaplarda
oda ısısında sakla.

2. Safranin Boyası

3. Malachite Green (% 3)

Malachite green (malahit yeşili- 3 g)distile su
içerisinde (100 ml) çözdür ve oda ısısında koru.

Boyama İşlemi:

1. İnce yayma (sürme) preperatı hazırla ve kurut.

2. Alkol içerisinde 5 dakika tespit et.

3. Distile su ile dikkatlice durula.

4. Kaynamakta olan safranin içerisinde 1 dakika
boya.

5. Distile su ile dikkatlice durula.

6. Malachite green ile1 dakika karşı boyama yap.

7. Distile su ile durula ve preparatı kurut.

8. Kurumuş preperatı uygun yolla kapat ve
incele.

Kalite Kontrol:

İçerisinde Cyclospora olduğu bilinen bir preperat (%
10’luk formalinde korunmuş olabilir)hazırlanır ve yeni
incelenecek örnek ile beraber boyanır. Cyclospora
oocystleri kırmızımsı-portakal sarısı renkte
boyanırlar. Arka planın unifor yeşile boyanmış olması
gerekir.

Trichrome Boyama

Dışkıda intestinal protozoaların incelenmesinde tek ve
en iyi sonuç veren yöntem dışkıdan ince yayma preperat
yaparak boyama tekniğidir. Kalıcı boyama ile boyanmış
preperatlarda cysts ve trophozoit taranması, tanınması
(bulma ve teşhis etme) ve devamlı kayıt maddesi
(kanıt) elde edilebilir. Küçük protozoalar ıslak
yöntemler ile (flotasyon vb) hazırlanan incelemelerde
görünmeyebilirken (hazırlama veya inceleme hatası vs)
boyanmış preperatlarda tespitleri daha kolay
olmaktadır.

Trichrome boyama tekniği hızlı, kolay basit bir boyama
metodudur. Bu boyama ile intestinal protozoalar,
insan hücreleri, mayalar yada diğer maddeler uniform
olarak boyanmış halde elde edilirler.

Örnek:

Boyama için kullanılacak olan taze dışkı örneği bir
lam üzerinde yayma yapılıp hemen tespit edilir. Tespit
için,

Schaudinn’s fiksative yada polivinil alkol (PVA)
kullanılır ve havada veya ısıtılarak (60°C) kurutulur.

Sodium acetate-acetic acid-formalin (SAF-sodyum asetat-
asetik asit-formalin) ile tespit edilmiş örneklerde
kullanılabilir.

Solusyonlar:

1. Ethanol (% 70) + iodine:

Etil alkol içerisine iyot kristalleri (iodine)
ekleyerek bir stok solusyonu hazırla. Solusyon tamamen
koyu bir renk alana kadar iyot ekle. Bu solusyonu
kullanacağında kırmızımsı-kahve rengi yada demli çay
rengi oluşana kadar % 70’lik etanol ilave et.

2. Ethanol % 70

3. Trichrome Boya

4. Acid-Ethanol % 90

Ethanol % 90 99.5 ml

Acetic acid (glacial) 0.5 ml

5. Ethanol % 95

6. Ethanol % 100

7. Xylene (Ksilen)

Boyama İşlemi:

1. Taze örneklerde preperatı Schaudinn’s
fiksativinden çıkartıp % 70 ethanoliçerisinde 5 dakika
beklet. Daha sonra % 70 Ethanol + iodine koyup bir
dakika beklet. Eğer örnek PVA yayması ise preperatı %
70 ethanol + iodine içimde 10 dakika beklet.

2. Preperatı % 70 Ethanol de 5dakika beklet.

3. Preperatı ikinci % 70’lik Ethanol içinde 3
dakika beklet.

4. Trichrome boyaya koyup 10 dakika beklet.

5. Fazla boyaları % 90’lık ethanol + acetic acid
ile uzaklaştır (1veya 3 saniye).

6. Örneği % 100 ethanol ile bir kaç defa durula.

7. İki kademeli % 100’lük ethanole koy (her biri
3 dakika).

8. İki kademeli xylene (ksilen) koy (her birinde
10 dakika).

9. Uygun lamel ile preperatı kapatıp yapıştır.

10. Mikroskopta 100X objektif ile (immersiyon oil)
en az 200 mikroskop sahası incele.

Kalite Kontrol:

İçerisinde protozoa bulunduğu bilinen (Giardia gibi)
PVA içerisinde tespit edilmiş bilinen bir örnek
kontrol örneği olarak bilinmeyen örnekle beraber
boyanmalıdır. Düzgün olarak tespit edilmiş ve doğru
boyanmış preperatlarda protozoa trophozoitlerinin
stoplazması mavimsi yeşil veya morumsu renklerde
belirir. Cysts (Kistler) daha morumsu olarak
belirirler. Çekirdek ve diğer yapılar (kromatid
yapılar, bakteriler ve alyuvarlar) bazan mora kaçan
kırmızı renkte görülürler.Glikojen solusyonlarda
eridiği için bu bölgeler temiz alanlar olarak belirir.
Geri plan ise genellikle yeşil renk boyanır ve iyi bir
renk zıtlığı oluşturarak parazitlerin daha iyi
belirmesini sağlar.

Mikroskobik İnceleme

Oküler Mikrometre kullanılarak Mikroskopların
Kalibrasyonu:

Doğro olarak kalibre edilmiş mikroskoplar
incelemelerde çok önemlidir. Çünkü organizmaların
özellikle parazitlerin büyüklükleri önemli bir teşhis
aracı olarak kullanılır. Kalibrasyon için iki mikro
metre kullanılır. Birinci mikro metre okülere
yerleştirilir. İkinci mikrometre mikroskop sehpasında
konulur ve her büyütmede iki mikrometrenin ne kadar
çakıştığı belirlenir. Sehpadaki mikrometrenin,
okülerde nekadar görüldüğü ve görülen mesafenin
aslında nekadar olduğu ile oranlanarak kalibrasyon
yapılır. Bu işlem her mikroskop için ayrı ayrı
yapılmalıdır.

Mikrometreyi sehpaya yerleştirip net ayarını yap ve
hem 0.1 mm hem de 0.01 mm çizgilerini görüntüle.
Okülerdeki mikrometrenin “0” çizgisi ile sehpadaki
mikrometrenin “0” çizgilerini çakıştır. Daha sonra,
diğer kısımda kalan bölümlerden hem sehpa hemde
okulerdeki metrelerden tam olarak çakışan iki çizgi
bulunur (bu iki aramesafenin mümkün olan en uzak
mesafelerden seçilir). Okülerdeki bu mesafe ile
sehpadaki mesafe arasınad oran kurularak kalibrasyon
tamamlanır. Örneğin sehpadaki mikrometrenin 36 bölmesi
okulerdeki 0.7 mm çizgisi ile çakıştı bu durumda
0.7/36= 0.019mm olarak hesaplanır.Yani okülerde sizin
1 mm olarak gördüğünüz cisim aslında 0.019 mm
büyüklüğünde demektir. Genelde bu ölçümler milimetre
yerine, mikrometre cinsinden verilir. Bu durumda
mesafe 1000 ile çarpılır sonuç 19 µm olarak bulunur
yani her bölüm her ünite (kesik çizgiler arası) bu
mesafeye eşittir. Bu işlem her büyütme için ve her
mikroskop için ayrı yapılır. Ayrıca mikroskop
obyektif, oküler değişimleri vya genel temizlikleri
sonrasında tekrarlanmalıdır. Kalibrasyon işlemi
sonrası mikroskop yanına bu işlem sonucu
kaydedilebilir.

Basit Yayma Preperat Hazırlanması:

Bu işlem öncesinde mikroskoplarda kalibrasyon
işleminin yapılmış olması tavsiye edilir.

Protozoan trophozoitleri, cysts, oocysts ve helminth
yumurtaları ve larvalarbu yöntemle görülüp teşhis
edilebilir.

Bu işlem için bir lam, lamel ve dışkı örneği
gereklidir. Az bir miktar dışkı alınıp lam üzerine
konur. eğer dışkı hala kıvamlı ise bir iki damla su
veya tuzlu su ile sulandırılır. Genellikle en az iki
örnek hazırlanması istenir. Bu sayede bir örnek iyot
ile boyanabilir. Bu yaymada dışkı kalınlığı çok
olmamalıdır. Lam altına konulan yazılar üstten
görünebilmeli ve okunabilmelidir (bak resim1).

Eğer arzu edilirse lamel, lam üzerine
yapıştırılabilir. Bu işlem için en ucuz ve kolay elde
edilebilen madde tırnak cilalarıdır (oje). İlk olarak
lamelin dört köşesi birer damla ile tespit edilir.
Daha sonra oje lamel etrafına açık kısım kalmayacak
şekilde sürülür ve kurumaya bırakılır. Bu şekilde
hazırlanan preperatlar uzun süre saklanabilir.
Saklanacak preperatlarda tuzlu su kullanılmamalıdır.
Bu işlem için diğer yapıştırıcılarda kullanılabilir.

Preperatı sistematik olarak incele. Bu işlem ilk
olarak 10 X objektif ile yapılmalıdır. Her hangi bir
nesne incelenmek istenirse o zaman büyük büyütme ile
inceleme yapılır.

Boyanmış Preperat Hazırlanması:
Kalıcı boyamalar ile hazırlanmış olan preperatlar
protozoan trophozoites ve cystlerini teşhis etmek yada
tür tayini yapmak için hazırlanır. Ayrıca daha sonraki
çalışmalar için kaynak oluşturur (uzman incelemeleri
vs).

İnceleme öncesinde çalışma ortamında aranan organizma
ile ilgili kaynaklar (kitap, resim yada pozitif olduğu
bilinen preperatlar) hazır olmalıdır. Hangi boyama
yapılacağı aranan organizmaya göre belirlenir.
Normalde her 3 örnekten bir tanesi kalıcı boyamalar
için hazırlanılması tavsiye edilir. Eğer dışkı örneği
prezervatifsiz olarak gelmiş ise hemen bir baget
(çubuk) ile biraz dışkı alınıp bir lam üzerine
sürülerek yayma yapılır. Dışkı çok kıvamlı ise bir iki
damla su ile sulandırılabilir. Bu preperat hemen
Schaudinn’in fiksativine konur. Bu aşamada preperat
kurutulmaz, kurumamasına dikkat edilir. Eğer PVA ile
tespit edilmiş örnek gelirse bir iki damla alınıp lam
üzerine homojen olarak ve yaklaşık 22×22
genişliğindeki lamel alanı kadar yayılır.

Boyama işlemi tamamlandıktan sonra preperat sistemik
olarak incelenir. Bu işlem için 100x objektif
kullanılır. En az 200 yada 300 mikroskop sahası
taranır. Eğer varsa görülen protozoa cysts yada
trophozoitleri tespit ve teşhis edilir ve rapor edilir.

belgesi-163

Belgeci