KOLESTEROL ANALİZİ

 

       Karaciğer, bağırsak, adrenal korteks ve yumurtalıklar, testisler ve plasentayı kapsayan üreme dokuları vücudun kolesterol havuzuna en büyük katkıyı yapmasına rağmen, kolesterol insanlarda hemen hemen tüm dokular tarafından sentezlenir. Kolesterol insanlardaki en yaygın steroldür ve vücutta belli sayıda bir grup işleve sahiptir. Örneğin kolesterol bütün hücre zarlarının bir bileşenidir ve safra tuzları, steroid hormonları ve D vitaminin öncül maddesidir.

 

       Karaciğer vücudun kolesterol dengesinin düzenlenmesinde merkezi bir role sahiptir. Örneğin karaciğer kolesterol havuzuna bazı kaynaklardan kolesterol gelir; diyet ile alınan kolesterol, ekstrahepatik dokularda sentezlenen kolesterol ve karaciğerin de novo sentez sonucu oluşan kolesterol. Karaciğer tarafından kolesterol safrada değişmemiş kolesterol olarak, periferik dokulara gönderilen plazma lipoproteinlerin bileşeni olarak veya barsak lümenine salgılanan safra tuzları olarak vücuttan elimine olurlar.

 

Kolesterolün Yapısı

 

       Kolesterolün yapısı, karbonları sırası ile numaralanmış olan dört adet bileşik halka ve son halkaya bağlanmış 8 üyeli dallanmış hidrokarbon zincirinden oluşmuştur. 27 karbon atomundan oluşur. Plazma kolesterolünün çoğu esterleşmiş bir şekildedir ( 3. karbona bir yağ asiti bağlıdır ). Esterleşme yapıyı daha da hidrofobik yapar ve bu hidrofobik özelliğinden dolayı ya bir lipoprotein partikülünün bir bileşeni olarak proteinle birlikte ya da safradaki fosfolipid ve safra tuzları tarafından çözünmüş halde taşınmalıdır.

       

Kolesterol Sentezi

 

       Kolesterodeki bütün karbonlar asetat’ dan sağlanır. NAPH, indirgeyici ekivalanları sağlar. Metabolik yol asetil CoA’ nın yüksek enerjili tioester bağı ile ATP’ nin uç fosfat bağının hidrolizi tarafından sürdürülür. Sentez, hem sitozol hem de endoplazmik retikulumda  bulunan enzimler ile birlikte sitozolde meydana gelir. Farklı insan popülasyonlarının diyetlerindeki kolesterolün miktarı çok değişkendir, hatta aynı kişide bile kolesterol alım miktarı günden güne anlamlı olarak değişebilir. Bu yüzden vücuttaki kolesterol sentez hızını kolesterol atılım hızına karşı dengelemek için düzenleyici mekanizmalar mevcut olmalıdır. Bu düzenlemede bir dengesizlik, dolaşımdaki kolesterol düzeyinin artmasına, bu da koroner arter hastalığı olasılığına yol açarken, kolesterolün safraya aşırı salgılanması ise kolesterolün safra kesesinde ve kanalında çökmesine neden olabilmektedir.

 

       2 Asetil CoA → Asetoasetil CoA→ 3- Hidroksi- 3- Metilglutaril CoA ( HMG CoA ) → Mevalonik Asit → 5- Pirofosfomevalonik asit → İzopentenil pirofosfat ( IPP) → DPP → GPP→ FPP→ Skualen → Lanosterol → Kolesterol

 

       HMG CoA’ dan Mevalonik asit oluşumunu katalizleyen enzim olan HMG CoA redüktaz, endoplazmik retikulumun bir iç membran proteinidir. Enzimin aktif bölgesi sitozolün içine doğru uzanır. Bu enzim kolesterol sentezinde hız kısıtlayan bir enzimdir. Kolesterol, HMG CoA redüktazın geri beslemeli bir inhibitörüdür, böylece daha fazla kolesterol sentezi önlenmiş olur. Hormonal düzenlemede ise insülin kolesterol sentez hızını artırırken glukagon kolesterol sentez hızını azaltır. Ayrıca bazı ilaçlarda ( Lovastatin ve mevastatin ) hız kısıtlayan enzimin geri dönüşümlü ve yarışmalı inhibitörleridirler. Bu ilaçlar hiperkolesterolemili hastalarda kolesterol düzeyini azaltmak için kullanılırlar.

 

Kolesterolün Yıkımı

 

       Kolesterolün halka yapısı insanlarda su ve karbondiokside metabolize edilemez. Daha ziyade, bütün sterol halkası olarak vücuttan şu şekillerde atılır. 1-) Feçes ile atılan safra asitlerine dönüşür, 2-) safra içine salgılanır, böylece kolesterol atılmak üzere barsağa taşınır. Barsaktaki kolesterolün bir kısmı atılmadan önce bakteriler tarafından değiştirilir. Bu şekilde oluşan başlıca bileşikler, kolesterolün indirgenmiş türevleri olan koprostenol ve kolestanol’ dür.

 

ZAK METODU İLE SERUM KOLESTEROL TAYİNİ

( TOTAL-ESTER- SERBEST KOLESTEROL )

 

Prensip : Asetik asit ile eritilmiş kolesterolün demir-3 klorür ve sülfürik asit ile verdiği ve miktarla orantılı olan kırmızı menekşe renk reaksiyonuna dayanır.

Reaktifler :

1-) FeCl3 ( 84 mg FeCl3 bunun yerine 140 mg FeCl36H2O alınır, 100 ml glasial asetik asit içinde eritilir. Koyu renkli cam kapaklı şişede saklanır. )

       2-) Sülfirik asit d:1,84 p.a.

       3-) Dijitonin çözeltisi, %0.5 gr. ( 0.5 gr dijitonin %50’ lik alkolde eritilir.)

       4-) Alkol- aseton karışımı ( eşit hacimde etil alkol %95 ve aseton karışımı)

       5-) Saf aseton

       6-) Kolesterol ana çözeltisi % 100 ( 100 mg saf kolesterol asetik asitde çözünür ve 100 ml’ye tamamlanır )

       7-) Kolesterol çalışma çözeltisi ( 10 ml ana çözelti + 90 ml asetik asit )

       😎 Glasial asetik asit

 

Deneyin yapılışı

 

       A-) TOTAL KOLESTEROL

 

       Bir santrifüj tüpüne, 0.1 ml serum ve 4 ml FeCl3 konur ve karıştırılır, 30 dakika kendi halinde bırakılır. Bundan sonra santrifüj edilir.

 

 Bir deney tüpüne,

       2 ml santrifüj tüpündeki süpernatan kısımdan alınarak konur.

       2 ml asetik asit

       2 ml sülfirük asit konur ve karıştırılır.

      

       Aynı anda başka bir deney tüpüne kör deney olarak,

       2 ml FeCl3              

       2 ml asetik asit

       2 ml sülfirk asit konur ve karıştırılır. 30 dakika beklenir. 560 nm de okunur. Standart eğri grafiğinde serumda kolesterol miktarı % mg olarak okunur.

 

 

       B-) SERBEST KOLESTEROL

 

       Bir deney tüpüne

       4 ml alkol- aseton karışımı

       0.5 ml serum konur. Kaynayan bir su banyosuna daldırılarak birkaç saniye tutulur. Çıkarılıp soğutulduktan sonra alkol- aseton karışımı ile 5 ml ye tamamlanır.

       Karıştırılıp, süzülür.

 

       Bir santrifüj tüpüne

       1 ml yukarda ki süzüntüden

       1 ml dijitonin çözeltisi konur, karıştırılır. 10 dakika bekledikten sonra santrifüj edilir. Üstteki sıvı atılır, dipteki çökelti üzerine 2 ml aseton konur, karıştırılarak ümülsiyon haline getirilir. Tekrar santrifüj edildikten sonra üstteki sıvı kısım atılır.

       Çökelti üzerine 4 ml FeCl3 konur ve eritilir. 

 

       Bir deney tüpüne,

       2 ml yukarıda anlatılan eriyik

       2 ml asetik asit

       2 ml sülfirik asit konur, karıştırılır. 30 dakika beklenir. Kör deney total kolesterolde anlatıldığı gibi hazırlanır.

       560 nm de okunur.

 

       C-) ESTER KOLESTEROL

 

       Ester kolesterol : Total kolesterol – Serbest kolesterol

 

 

Standart eğri grafiğinin hazırlanması

	Kör	Tüp no 1	2	3	4	Nomune
Kolesterol çözeltisi (%10 mg)	–	0.5	1	1.5	2 ml	–
FeCl3	2	2	2	2	2 ml	–
Serum süzntüsü	–	–	–	–	–	2 ml
Asetik asit	2	1.5	1	0.5	–	2 ml
Sülfürik asit	2	2	2	2	2	2 ml
kolesterol	0	102.5	205	307.5	410 mg

 

       30 dakika oda sıcaklığında beklenir, köre karşı 560 nm de okunur. Logaritmik kağıda standart eğri grafiği çizilir.

 

       Yorumlama : Normal değerler %150-190 mg ( Total kolesterol )

                              Ester kolesterol : Totalin %65-75

       Ağır karaciğer yetersizlikleri, ağır enfeksiyon hastalıklarında kolesterol düzeyinde artış görülür. Lipoid nefroz, retansiyon ikteri, miksödem, diyabet, ateroskleroz ve ksantomatozda kolesterol düzeyinde artış görülür.

       Karaciğer koması ve sirozda ise kolesterol ester düzeyinde azalma gözlenir.

    

BLOOR METODU İLE KOLESTEROL ANALİZİ

 

       Prensip :

       Kloroformda eritilmiş kolesterolün, asetik asit anhidridi ve sülfirik asit ile verdiği ve kolesterol miktarı ile orantılı olan renk reaksiyonuna dayanır.

 

       Reaktifler:

  

1)      Bloor ayıracı ( 3 hacim etil alkol + 1 hacim eter karıştırılır.)

2)      Kloroform ( saf )

3)      Asetik asit anhidridi

4)      Sülfirik asit

5)      Asetilan karışım ( 24 ml kloroform + 15 ml asetik anhidrid + 1 ml sülfirik asit karıştırılır, soğuduktan sonra kullanılır. ) Her defasında taze hazırlanır.

6)      Dijitonin çözeltisi ( 0.5 gr dijitonin %50 lik alokolde eritilir ve 100 ml’ ye tamamlanır.)

7)      Kolesterol ana çözeltisi % 80 mg ( 80 mg kolesterol, 100 ml kloformda eritilir iyice karıştırılır.)

8)      Kolesterol çalışma çözeltisi % 8 mg ( 1 ml ana çözeltisi + 9 ml kloroform iyice karıştırılır.)

9)      Standart eğri grafiği için kolesterol çalışma çözeltisi % 20 mg ( 5 ml ana çözelti + 15 ml kloroform )

     

       Deneyin yapılışı :

     

A.     TOTAL KOLESTEROL :

     

       Cam kapaklı bir tüp veya 25 ml lik bir ölçü silindiri içine

 

       1 ml serum

       24 ml Bloor ayıracı konur, kuvvetle çalkalanarak karıştırılır. Ara sıra karıştırmak sureti ile 30 dakika yan yatırılarak beklenir. Bundan sonra süzgeç kağıdı ile süzülür. Süzüntüden 5 ml alınıp bir bahar içine konur. Buharlaşması için beklenir. Eter kokusu kaybolduktan sonra kaynar su banyosu üzerinde veya etüvde alkol kısmının uçması için bekletilir. İyice kuruma sağlandıktan sonra eher içindeki kuru kalıntı iki üç kerede toplam 5 ml olmak üzere kloroformla eritilip alınır. Bu ekstre bir deney tüpüne aktarılır. Beherdeki bulaşıklık 5 ml asetilan karışımı ile çalkalanarak aynı tüpün üzerine konur.

       Böylece deney tüpünde toplam hacim 10 ml olmuş olur.

    

       Bir başka deney tüpüne

 

       5 ml kolesterol çalışma çözeltisi % 8 mg

       5 ml asetilan karışımı konur ve karıştırılır. Tüplerin hepsi 20 0C sıcaklıkta ve karanlıkta 15 dakika bekletilir. Distile su kör olmak üzere 660 nm de okunur. Numune ve standart tüplerinin optik dansitelerinden hareket ederek aşağıdaki formüle göre numune serumdaki kolesterol miktarı bulunur.

 

       Serum kolesterol % mg : ( Numune optik dansitesi / Standart optik dansitesi ) X 200

 

MODİFİYE ZAK METODU İLE KOLESTEROL ANALİZİ

 

       Serum proteinleri presipite edilir ve kolesterol etanol ile ekstrakte edilir. En çok kullanılan numune serumdur. Antikoagülan olarak heparin kullanılmışsa hücreler ve plazma arasında su kaymasına yol açmadığından plazma kullanılabilir. Genellikle bir koruyucu gerekmez. Kolesterol oda ısısında 5 güne kadar, buzdolabında ise –20 oC 5 yıla kadar dayanıklıdır.

 

       Reaktifler :

  

1-Stok demir reaktifi ( % 2.5 g FeCl3.6H2O )

            2.5 g demir 100 ml % 87 lik fosforik asitte çözülür.

2-Renk reaktifi % 0.2

8 ml demir stok çözeltisinden alınıp 100 ml konsantre sülfirik asitte çözünür. 6-8 hafta stabildir.

 

       Deneyin yapılışı :

 

1) 15 ml lik test tüpüne 0.1 ml serum konur ve sürekli karıştırılarak hızlı bir şekilde 10 ml etanol eklenir. Hemen karıştırılır ve tüpün ağzı kapatılarak 10 saniye çalkalanır.

2)Presipitatı ayırmak için 5 dakika santrifüj eklenir. Gerekli sayıda 50 ml lik erlen alınır.

	KÖR	NUMUNE
Etanollü süpernatant	–	4 ml
Etanol	4 ml	–
Renk reaktifi	4 ml	4 ml

 

3)Etanolün altında bir tabaka olacak şekilde belli bir açı ile erlenin dip kısmına dikkatlice 4 ml renk reaktifi eklenir. 10 saniye erlen çevrilerek karıştırılır.

4)Çalkalama durdurulur. 30 dakika erlenler bekletilir. 550 nm de okunur.

 

       Normal değerler : 45 yaşa kadar 120-260 mg/dl, 45-60 yaş 140-300 mg/dl

 

       Analiz prensibi : Konsantre H2SO4 ile solvent ortamı yaratılarak OH kısmı dehidratasyon ve oksidasyona uğratılır. Sonuçta elde edilen kolestopolienler renk veren ürünlerdir. Fe gibi metaller oksidasyonu hızlandırır.

 

       Kolesterol ® 3.5 kolestadiene ® pentaenilik iyon ® kolestapolien

     

       Bu reaksiyon zincirinde sıra ile dehidratasyon, oksidasyon, oksidasyon reaksiyonları meydana gelir.

 

belgesi-481