KAN GLUKOZ TAYİN YÖNTEMLERİ

 

       Glukoz insan kanında bulunan en önemli monosakkarittir.  Glukoz insan ve hayvan dokularının enerjisini sağlar. Bu canlıların kalori ihtiyaçlarının yarısından fazlası glukoz tarafından sağlanmaktadır. Glukoz altı karbona sahip bir aldoheksozdur.

 

       Glukoz meyve sularında, nişastada, şeker kamışında, maltoz ve laktozda bulunur. Hidroliz ile açığa çıkar. Organizmanın kullandığı ve kanda taşınan en önemli şekerdir. Diabetes mellutuslu hastalarda idrarda da bulunur. İndirgeyici bir şekerdir. Maya tarafından fermente olur. Nitrik asidde çözünerek sakkarik asid oluşturur.

 

       Glukoz barsaklardan emilerek kana geçtikten sonra vücudun enerji ihtiyacı doğrultusunda glikolitik yola girerek piruvata kadar yıkılır. Glukozun piruvata yıkımı aerobik glukoliz ile olmaktadır ki bu yolu mitokondriye sahip hücreler kullanmaktadırlar.  Ertrositler, kornea, lens ve retina hücreleri çok az  mitokondri içerirler bu nedenle glikolitik yol bu dokuların pirimer enerji gereksinimlerini karşıladıkları yoldur. Bu dokularda aneorobik glikoliz olur ki son ürün laktik asiddir.

 

       Glukozun kandan hücrelere kullanılmak üzere girişinden sorumlu yegane hormon insülindir. İnsülin anabolizan bir hormondur. İnsüline zıt olarak çalışan bir diğer hormon ise glukagon hormonudur. Dolayısı ile kan glukoz konsantrasyonunu bu iki hormon öncelikli olarak etkilemektedirler. Kan glukozu azaldığında ve hücrelerin enerji ihtiyaçları arttığında glukagon hormonunun etkisi ile glikojen depoları boşalmaya ve kan şekeri artmaya başlar. Kan şekeri arttığında ise hücrelere glikozun girişi insülin hormonu aracılığı ile olmaktadır. Kan glukoz seviyesi karaciğer tarafından düzenlenir.

 

Kan glukozunun kontrolü başlıca iki hormonun kontrolündedir. Bunlar insülin ve glukagon hormonlarıdır. Etkileri ise şu şekildedir.

 

 

İNSÜLİN                                                                              GLUKAGON

 

·        ·        Glikolisis­                                                                 .   Glikojenılisis ­

·        ·        Glikogenesis ­                                                          .   Glikojen ® Glukoz  

·        ·        Glukoz ® glikojen ® piruvat®acetyl-CoA                .   Glikoneogenesis ­

·        ·        Lipogenesis ­                                                           .  Yağ asidi ® Asetil CoA ® Keton

·        ·        Glikojenolisis¯                                                         .   Proteinler ® Amino asidler   

 

 

 

Kan glukoz ölçümlerinin başlıca iki amacı vardır. Bunlar ya hiperglisemiyi yada hipoglisemiyi tespit etmektir.

 

*** Normal açlık plazma glikoz seviyesi :  FPG  < 110 mg / dl    olmalıdır.

 

 

HİPERGLİSEMİ                                                       HİPOGLİSEMİ

 

                                                                                  .   Açlık

Kan glikozu  > 110 mg / dl                                          .   İlaçlar

Diabetes mellitus                                                         .   Etanol

                                                                                  .   Hepatik hastalıklar

Tip I                                                                           .   İnsülinoma

·        ·        Beta- cell yıkımı                                                          .   Doğmasal hiperinsülinizm

·        ·        Absolut insülin yetmezliği                            G-6 Fosfataz yetmezliği ( Vov Gierke’s hast )

·        ·        Otoantibadiler                                                

·        ·        İslet-cell otoantibadiler                                   

·        ·        İnsülin otoantibadiler

·        ·        Glutmik asid dekarboksilaz otoantibadiler

Tip  II

·        ·        İnsülin resistansı

·        ·        Relatif insülin yetmezliği

Diğer

·        ·        Sekonder

·        ·        Beta-cell genetik fonksiyon yetmezliği

·        ·        Pankreas hastalıkları

·        ·        Endokrin hastalıklar

·        ·        İlaçlar

·        ·        İnsülin reseptör abnormalitesi

Gestasyonel

·        ·        Gebelikte glikoz intoleransı

·        ·        Metabolik ve hormonal değişime bağlı

 

 

KAN GLUKOZ TAYİN YÖNTEMLERİ

 

MODİFİYE SOMOGYI-NELSON METODU:

 

Prensip:

 

       Glukoz tayini yapılacak olan kan, plazma, yada serum örneği,, içersinde glukozun yanı sıra indirgeyici özelliği bulunan proteinleri çöktürmek ve ortamdan uzaklaştırmak için deproteinize edilir. Bu amaçla Çinko Hidroksit kullanılır. Daha sonra numune Alkali Bakır solüsyonu ile ısıtılır. Cuprik ( cu⁺² ) bakır iyonları glukozu okside eder ve Cuprous ( cu⁺¹ ) iyonları oluşur. Bu esnada oluşan bu bakır miktarına eşit miktarda Arsenomolibdat indirgenir. Renk değişimi kolorimetrik olarak ölçülür ve glukoz kantitasyonu yapılır.

 

Normal kan glukoz değeri: Tam kanda ( açlık ) 65 –110 mg / 100 ml’dir.

 

Numune:

       Bu yöntemle tam kan, serum, plazma yada serebrospinal sıvıda glukoz tayini yapılabilir. Plazma için herhangi bir antikoagulant madde kullanılabilir. Tam kan hemen ölçümlerde kullanılmayacaksa, içersine glikolizisi durdurmak için Sodyum Florid katılarak buzdolabında saklanmalıdır.

 

Reaktifler:

 

1-     1-     Sodyum hidroksit ( NaOH ), 0,08 N

2-     2-     Sodyum hidroksit ( NaOH ), 1 N

3-     3-     % 5’lik Çinko sülfat solüsyonu, ( ZnSO₄ )

4-     4-     % 10 Bakır Sülfat solusyonu, ( CuSO₄ )

5-     5-     Alkalen bakır solüsyonu,

 

Çözelti A.  12 gr. Na₂CO₃

                   8 gr. NaOH CO₃

                        6 gr. Potasyum sodyum tartarat ( C₄N₄KNaO₆ ( 4H₂O )

                  72 gr. Na₂SO₄ Anhdril.

Saf suda eritilir ve 400 ml ye tamamlanır.

 

Çözelti B.  28 gr. Disodyum fosfat anhdr. ve 40 gr. Rochelle tuzu ( KnaC₄H₄O₆ . 4H₂O ) tartılıp bir bir balon jojede 700 ml saf suda eritilir. Magnetik karıştırıcıda bunlar çözünürler iken üzerine 100 ml 1 N Sodyum hidroksit ve 80 ml % 10 Bakır sülfat yavaş yavaş eklenir. Daha sonra üzerine 180 gr Sodyum sülfat anhdr. eklenir ve en son balon joje saf su ile  1 L ye tamamlanır.

 

Kullanmadan önce 4 volüm A çözeltisi 1 volüm B çözeltisi ile karıştırılır.

 

6-     6-     Arsenomolibdat Çözeltisi: 25 gr. ( NH₄ )₆Mo₇O₂₇ . 4H₂O ( amonyum molibdat ) 450 ml saf suda eritilir. 21 ml derişik H₂SO₄ ilave edilip karıştırılır. 25 ml saf suda eritilmiş 3 gr Disodyum hidrojen arsenat ( Na₂HasO₄ . H₂O) ilave edilir. Çözelti karıştırıldıktan sonra etüvde 37 C⁰ de 24-48 saat bekletilir.

 

7-     7-     Standart glukoz çözeltisi: % 50 mg, % 100 mg, %200 mg, % 300 mg, % 400 mg.

 

Standart Kalibrasyon Eğrisi:

 

       Stok standardı 10 ml.lik tüplerde 0.5, 1.0, 2.0, 3.0 ve 4.0 ml dilüe edilir. Bu çalışma standartları  50, 100, 200, 300, 400 mg glukoz / 100 ml konsantrasyona eşittir. Daha sonra test prosedürü bunlara aynen uygulanır. Blank referanslığında 530 nm dalga boyunda spektrofotometrede absorbansları alındıktan sonra, alınan absorbansa ve konsantrasyona göre bir grafik çizilir.

 

Test Prosedürü:

 

·        ·        15 x 125 mm’lik deney tüplerine aşağıdaki sırada blank, numune ve standart çöeltileri sırayla konur. Sodyum hidroksit konduktan sonra 5 dk. kadar beklenir ve Çinko sülfat eklenir. Tüpler iyice karıştırılır.

 

	BLANK	NUMUNE	STANDART
Saf su ( ml )	1 ml	0	0
Standart ( ml )	0	0	1.0
Numune ( kan, serum, CSF ) ml	0	1.0	0
NaOH, 0,08 M	7.0	7.0	7.0
ZnSO4 ( ml )  ml	2.0	2.0	2.0

 

·      ·      Tüm tüpler 2500 rpm’de 5 dk. Santrifüj edilir.

·      ·      Blank için 1, standart ve numune sayısı kadar da Folin- Wu tüpleri alınır. Bu tüplere süpernatanttan birer ml konur. Her tüp mutlaka etiketlenmelidir.

·      ·      Her tüpe 2.0 ml Alkali bakır çözeltisi konur ve karıştırılır.

·      ·      Tüpler su banyosunda 15 dk kaynatılır. İşlem sonunda akan musluk suyunda tüpler soğutulur.

·      ·      Her tüpe 1.0 ml Arsenomolibdat reaktifi konur ve tüpler karıştırılır. Tüpler saf su ile 25 ml ‘lik hacime tamamlanır.

·      ·      550 nm dalga boyuna ayarlanmış spektrofotometrede tüm tüpler köre karşı okunur.

·      ·      Standart eğrinin referanslığında numunenin glukoz konsantrasyonu hesaplanır.

 

 

Not: Eğer standart grafik değilde tek bir standart kullanılıyorsa şu formül yardımı ile   numunenin glukoz konsantrasyonu hesaplanabilir.

 

                        

Nc = N_AB / S_AB x Sc Nc : Numunenin konsantrasyonu

                                                              N_AB: Numunenin absorbansı

                                                              S_AB : Standardın absorbansı

                                                              Sc   : Standart konsantrasyonu

 

         

GLUKOZ OKSİDAZ ( Fermco Test ) METODU

 

Prensip :

       Serum, plazma, CSF’ de bulunan glukoz moleküler oksijen tarafından  Glukonic asid ve H₂O₂’ ye okside edilir. Bu reaksiyonu Glukoz Oksidaz enzimi katalizler. H₂O₂ Kromojen Peroksidaz enziminin etkisi ile  renkli bir bileşiğe oksitlenir. Bu bileşik H₂SO₄ etkisi ilekalıcı kırmızı renk verir. Ölçüm kolorometrik olarak yapılır.

 

            1.  Glukoz + O₂ + H₂O  Glukoz Oksidaz    Glukonik asid + H₂O₂

           

            2.  H₂O₂ + Chromogen  Peroksidaz   amber compaund

 

            3.  Amber Compaund + H₂SO₄………..    Stable red pigment

 

Normal Değerleri:

 

Serum- Plazma ( açlık ) : 70 – 110 mg / 100 ml

Serebrosipinal sıvı ( açlık ) : 45 – 80 mg / 100 ml

 

Numune:

Kan alındığında eritrosit hemolizinin olmamasına dikkat edilmelidir. Çünkü eritrositlerin sitoplazmik glikolitik enzimler serum-plazma glukozunun yanlış ölçülmesine yol açarlar. Bunu engellemek için Florid kullanılmamalıdır. Çünkü florid glikolitik enzimleri baskılamakla kalmaz deneyde kullanılan enzimleri de baskılar. En iyi ölçüm kan alındıktan hemen sonra serumu çıkartılıp yapılan ölçümdür.

 

Reaktifler:

 

1-     1-     Enzim- Kromogen Buffer Reagent.

2-     2-     Sülfirik Asid ( 7.2 N )

3-     3-     Glukoz Standardları: 300 mg anhidroz reagent-grade glukoz ( dextroz ), 80 ml deiyonize suda çözülür. Üzerine 0,25 g benzoik asid ilave edilir ve karıştırılır. Karışımın üzeri 100 ml ye tamamlanır. Bu stok solüsyonda 60, 120 ve 240 mg / 100 ml’lik standart çalışma solüsyonları hazırlanır.

 

Test Prosedürü:

 

·        ·        13 x 120 mm’lik deney tüplerine numune, standard ve kör için birer ml enzim-kromogen karışımı reaktifinden konarak tüpler 37 C⁰ da su banyosuna kaldırılır.

·        ·        Aynı anda 20 ml bilinmeyen serumdan numune tüpünün üzerinde tabaka oluşturacak şekilde konur ve hemen karıştırılır. Blank sadece enzim- kromojen reaktifi içermelidir. Standartlar için de numuneye yapılan işlem yapılır.

·        ·        10 dk. sonra reaksiyon her tüpe 4,0 ml 7,2 N H₂SO₄ eklenerek durdurulur.

·        ·        Blank referanslığında standard ve numunenin absorbansları 540 nm dalga boyunda spektrofotometrik olarak okunur.

 

Hesaplama:

 

       Aşağıdaki formül yardımı ile glikoz konsantrasyonu bilinmeyen örneğin glukoz konsantrasyonu hesaplanır.

 

Numunenin absorb. / Standardın absorb. X  Standardın konstr. = Glukoz ( mg / 100 ml )

 

 

 

belgesi-477