Belgeci.com – Bilgi Paylaştıkça Çoğalır

Domates yetiştiriciliğinde etkili sonuç genellikle 20-25 mg/kg konsantrasyondaki 4-CPA çözeltisinin çiçek kümeleri üzerine püskürtülmesi ile alınmaktadır.

4-CPA analizlerinde kalibrasyon aralığı 0-10 µg/ml olarak belirlenmiştir. Bu nedenle, kalibrasyon eğrilerinin hazırlanmasında 1, 2, 3, 4, 5 ve 10 µg/ml 4-CPA konsantrasyonlarına eşdeğer olan 4-CPA ME standart çözeltileri kullanılır.

Standart çözeltiler gaz kromatografik olarak analiz edilerek 4-CPA metil esterlerinin relatif ECD duyarlılıkları saptanır. Standart kalibrasyon eğrilerinin hazırlanmasında konsantrasyona (µg/ml) karşılık ECD ölçüm sonuçları (Hz) esas alınır.

Kullanılan kapiler kolon (CP-sil8, 30 m x 0.25 mm ID), öncelikle boş enjeksiyon yapılmak suretiyle, kolondan kaynaklanabilecek olası girişimlerin belirlenmesi amacıyla test edilir. Kolon separasyon etkinliğinin test edilmesi amacıyla sırasıyla 10 ve 10 ng/µl konsantrasyonlarındaki 4-CPA’ye eşdeğer 4-CPA ME içerecek şekilde hazırlanır ve kolona enjekte edilir. Kolonda separasyonun tekrar edilebilirliğinin belirlenmesi için ise 1, 2, 3, 4 ve 5 ng/µl 4-CPA konsantrasyonlarına eşdeğer olan 4-CPA ME standart çözeltilerinden yararlanılır.

4-CPA asit formdan ester forma dönüştürülmeleri amacıyla CH₃OH/H₂SO₄ esterifikasyon yöntemi kullanılır. Buna göre, asit formda ve metanol içerisinde hazırlanan standart çözeltinin 2 ml’si 25 ml’lik bir deney tüpüne aktarılır. Üzerine yavaş yavaş konsantre H₂SO₄ ilave edilir ve bir dakika boyunca çalkalanır. Oda sıcaklığında, arasıra karıştırılmak suretiyle 10 dakika bekletildikten sonra esterifikasyon reaksiyonu tamamlanır.

Oluşan metil esterin ekstraksiyonu amacıyla tüp içerisine 10 ml su, 2 g NaCl ve 2 ml n-heksan ilave edilir ve tüp içeriği vorteks karıştırıcı kullanılarak 2 dakika kuvvetlice çalkalanır. Fazlar ayrıldıktan sonra, üstte kalan n-heksan fazı pastör pipeti ile alınıp 2 ml’lik örnek şişesine aktarılır. Mümkünse hemen analize alınır ve/veya analiz öncesi (-18 ^oC)’de saklanır.

Esterifikasyon yönteminin uygulananbilirliğinin test edilmesi amacıyla, 1, 2, 3, 4, 5 ve 10 ng/µl konsantrasyonlarda metanolde hazırlanmış 4-CPA çözeltilerinin esterifikasyonu gerçekleştirilerek elde edilen esterler gaz kromatografik olarak analiz edilir. Böylelikle 4-CPA için 1-10 ng/µl aralığında esterifikasyon yönteminin uygulananbilirliği kontrol edilir.

Derin dondurucudan çıkartılan domates örneği bir süre oda sıcaklığında bekledikten sonra mikserde parçalanır. Parçalanmış domates örneği oda sıcaklığına ulaşıncaya kadar bekletilir.

Domates bünyesinde serbest formda bulunan kalıntının yanısıra bağlı ve/veya konjuge formdaki kalıntının da belirlenebilmesi amacıyla alkali hidroliz yöntemi uygulanır. Bu amaçla 400 ml’lik bir behere 25 g domates tartılır ve üzerine 60 ml saf su ve 15 ml 1 N NaOH çözeltisi ilave edilir (pH > 10.0). Geri kazanma denemelerinde örneklere uygun miktarda 4-CPA ilavesi gerçekleştirilir. Örneğe ilave edilen 4-CPA miktarları ise domateslerdeki kritik kalıntı düzeyinden (0.5 mg/kg) düşük ve yüksek durumlar gözönüne alınarak 0.0 (kontrol), 0.1, 0.5 ve 1.0 ng/µl olarak belirlenmiştir.

Karışım çalkamalı su banyosunda 95 ⁰C’de 2 saat süreyle ısıtılarak hidroliz edilir. Süre sonunda örnek karışımından buharlaşma yolu ile uzaklaşan su kadar bidistile su örneğe ilave edilir.

Alkali hidrolizinin ardından kalıntının ekstraksiyonu gerçekleştirilir. Buna göre hidrolizat yaklaşık 5 ml %20 H₂SO₄ çözeltisi ilave edilmek suretiyle asitlendirilir (pH < 1.0). 200 ml aseton çözeltisi ilave ediltikten sonra karışım homojenizatörde orta devirde 2 dakika süreyle homojenize edilir. Homojenize edilmiş örnek 250 ml’lik ölçü silindirine filtre edilir. Bu aşamada filtratın tamamı değil teorik filtrat hacminin (V_f) %80’i 1000 ml’lik bir ayırma hunisine aktarılarak ekstraksiyonda kullanılmıştır. Bu sayede kalıntı miktarının hesaplanmasında kullanılan formüller basitleştirilmiştir.

Teorik filtrat hacmi ilave edilen 200 ml aseton, 15 ml 1 N NaOH çözeltisi, yaklaşık 5 ml %20 H₂SO₄ çözeltisi ile örnekte doğal olarak bulunan suyun toplam hacmidir. Teorik filtrat hacminin hesaplanmasında aseton-su hacim kontraksiyonu göz önünde bulundurulmalıdır. 200 ml aseton ve 100 ml su için bu değer 5 ml’dir. Yani 200 ml aseton ile 100 ml suyun toplam hacmi 295 ml’dir.

Ayırma hunisine aktarılan filtrat üzerine V_f / 10 g NaCl ilave edilmiş ve 3 dakika kuvvetlice çalkalanır. Fazların ayrılması için yaklaşık olarak 30 dakika beklenir. Alttaki sulu faz atıldıktan sonra organik faz hacmi (V₀) kaydedilir ve ardından içerisinde V₀ / 10 g anhidroz Na2SO4 bulunan bir erlene aktarılır. Organik faz anhidroz Na2SO4 üzerinde 20 dakika boyunca bekletilerek kurutulur. Süre sonunda organik faz siyah bant filtre kağıdı üzerinden 250 ml’lik bir Rotary balonu içerisine aktarlır. Filtre tabakası 20 ml etil asetat ile yıkanarak Rotary balonuna aktarılır.

Organik faz önce jel kromatografik, daha sonra asit-baz partitisyonu ile temizlenmelidir. Jel kromatografik temizleme amacıyla organik faz 40 ⁰C’de Rotary evaparöterde, son hacmi yaklaşık 1 ml olacak şekilde konsantre edilir. Konsantre örnek üzerine 4.5 ml etil asetat eklenir ve hafifçe çalkalanır. Üzerine 4.5 ml sikloheksan ilave edilerek hafifçe çalkalanır. Örnek toplam hacminin yaklaşık %50 si (yaklaşık 5 ml) Bio Beads S-X3 dolgulu kolonuna enjekte edilir. Kolon çıkışından alınan eluat daha önceden saptanan eluat sınırları kullanılarak toplanır.

Asit-baz partitisyonu ile temizleme amacıyla jel kromatografi kolonundan toplanan eluat, 15 ml etil asetat:sikloheksan karışımı (1: 1) ile birlikte 100 ml’lik ayırma hunisine aktarılarak 2X 30 ml %4’lük NaHCO₃ ile ekstrakte edilir. NaHCO₃ fazları birleştitildikten sonra 3-4 ml %20’lik H₂SO₄ ilave edilerek asitlendirilir. Bu sırada açığa çıkan CO₂, hafif karıştırmak suretiyle uzaklaştırılır. Asitlendirilmiş NaHCO₃ fazları 3 x 20 ml diklormetan ile ekstrakte edilir ve diklormetan fazları birleştirilir.

Diklormetan ekstraktı, üzeri 1 cm Na₂SO₄ kaplı siyah bant filtre kağıdı üzerinden filtre edilir ve filtre tabakası 2-3 ml diklormetan ile yıkanır. Diklormetanın tamamı 40 ⁰C’de Rotary evaparatör yardımıyla buharlaştırılır. Kalıntı azot gazı akımında tamamen kurutulur ve kurutulmuş kalıntı 2 ml metanol ilave edilerek tekrar çözündürülür.

Bundan sonra, asit formda ve metanol içerisinde hazırlanmış standart çözeltinin tamamı 25 ml’lik bir deney tüpüne aktarılır. Üzerine yavaş yavaş konsantre H₂SO₄ ilave edilir ve bir dakika boyunca çalkalanır. Oda sıcaklığında, arasıra karıştırılmak suretiyle 10 dakika bekletildikten sonra esterifikasyon reaksiyonu tamamlanır.

Oluşan metil esterin ekstraksiyonu amacıyla tüp içerisine 10 ml su, 2 g NaCl ve 2 ml n-heksan ilave edilir ve tüp içeriği vorteks karıştırıcı kullanılarak 2 dakika kuvvetlice çalkalanır. Fazlar ayrıldıktan sonra, üstte kalan n-heksan fazı pastör pipeti ile alınıp 2 ml’lik örnek şişesine aktarılır. Mümkünse hemen analize alınır ve/veya analiz öncesi (-18 ^oC)’de saklanır.

Hazırlanan çözeltinin analizi gaz kromatografik (GC-ECD) olarak gerçekleştirilir. Bu amaçla örneğin 1 µl’si SE-54 kapiler kolon ve/veya muadili olan bir kapiler kolona enjekte edilir. Kromatografik koşullar Çizelge 2’de verildiği gibidir.

Çizelge 2. GC-ECD operasyon koşulları

GC-ECD analizi elde edilen sonuçların kalitatif ve kantitatif doğrulaması GC-MS kullanılarak gerçekleştirilir. Buna göre GC-ECD analizi yapılan örneklerin her biri GC-MS kullanılarak analiz edilir. Bu amaçla Agilent 6890 model bir gaz kromatograf, Agilent 5937 model kütle seçici dedektör, Agilent 7683 model otoenjektör-otoörnekliyici entegre sistemi kullnılmaktadır.

GC-MS performansının optimizasyonu amacıyla 170 ⁰C’de ototonlama işlemi gerçekleştirilir. Bu amaçla pentaflorotributilamine ait iyonlar (m/z 69, 219, 502) kullanılır. GC-MS operasyon koşulları Çizelge 3’de verilmiştir.

Çizelge 3. GC-MS operasyon koşulları

Domatesdeki 4-CPA kalıntı miktarı mg/kg olarak ifade edilir. Hesaplanan kalıntı düzeyleri, ortalama geri kazanma oranları göz önüne alınarak düzeltilir.

Hesaplamada kullanılan eşitlik aşağıdaki gibidir :

Burada ;

C_t           = Test çözeltisindeki kalıntının konsantrasyonu, µg/ml

C_S          = Standart çözeltinin konsantrasyonu, µg/ml

A_t       = Test çözeltisi içindeki kalıntının pik alanı,

A_S      = Standart çözeltinin pik alanı,

a        = Standart eğrinin eğimi

b       = Kalibrasyon eğrisinin y-eksenini kestiği nokta

Kalıntı (ppm) = C_t x V_t / m

Burada ;

C_t           = Test çözeltisi içerisindeki kalıntının konsantrasyonu, µg/ml

V_t       = Test çözeltisinin hacmi, ml

m      = Test çözeltisinin temsil ettiği örnek miktarı, g

Düzeltilmiş kalıntı (ppm) = (Kalıntı (ppm) / R ) x 100

Burada ;

R = Geri kazanma oranı, %

Çalışma yönteminin doğru olarak, eksiksiz ve modifiye edilmeden takip edilmesi çalışma güvenliği açısından zorunludur.

Bu yöntemde kullanılan her bir kimyasal ait toksik ve/veya karsinojenik etki tek tek açıklanmamakla birlikte her kimyasal maddenin potansiyel sağlık riski taşıdığı bilinerek hareket edilmelidir. Bu nedenle çalışma sırasında oldukça dikkatli olunmalıdır :

Çalışma sırasında oluşacak interferanslar kullanılan solventlerde, cam malzemelerde ve diğer örnek hazırlama ve/veya ön işlemlere ait aparatlarda kontaminasyona neden olabilir. Bu nedenle her analizde mutlaka yalnızca çözücünün kullanıldığı bir kör ile okuma yapılmalıdır. Ayrıca dikkat edilmesi gereken noktalar aşağıda verilmiştir :