Belgeci.com – Bilgi Paylaştıkça Çoğalır

6. BESİYERLERİNİN KULLANIMI

6.1. Amaca Uygun Besiyeri Seçimi

            Çeşitli mikrobiyolojik analizlere yönelik olmak üzere kullanılacak besiyerinin seçimi, çalışmanın sağlığı açısından en önemli aşamalardan birisidir.

            Mikrobiyolojide farklı disiplinler materyale ve/veya geliştirilmesi istenen mikroorganizmaya göre kayda değer ölçüde değişmek üzere farklı besiyerleri kullanmaktadırlar. Kuşkusuz, farklı disiplinler tarafından aynı amaçla kullanılan pek çok besiyeri olduğu gibi aynı disiplin tarafından aynı amaçla kullanılan farklı besiyerleri de bulunmaktadır. Bu konuda ticari firmalar tarafından hazırlanan besiyeri kataloglarında ayrıntılı bilgi bulunabilir.

6.2. Besiyeri Hataları

            Besiyerlerinde, doğrudan analiz sonucuna yansıyabilecek çeşitli hatalar ile bunların olası nedenleri aşağıda listelenmiştir.

            Dehidre besiyerinde topaklaşma: Depolamada aşırı nem, dehidre besiyeri kutu kapağının uzun süre açık kalması ve/veya gevşek kapatma, besiyerinin çok eski olması.

            Yanlış pH: Nötral olmayan su kullanımı, aşırı ısıtma, dehidre besiyerinin çok eski olması, yanlış tartım, pH ‘nın yanlış sıcaklıkta ölçülmesi, sulandırmadan sonra sterilizasyonun zamanında yapılmaması, yetersiz yıkanmış cam malzeme kullanılması, dehidre besiyerinin nem alması.

            Anormal renk: Saf olmayan su kullanımı, kirli cam malzeme, yanlış pH, aşırı ısıtma, hatalı tartım, dehidre besiyerinin çok eski olması. Selenit içeren besiyerlerinde dehidre besiyerinin uzun süreli depolanmasına bağlı olarak hazırlanmış besiyerinde sarı yerine kırmızı bir renk görülebilir. Bu durum besiyeri performansını olumsuz etkilemez.

            Bulanıklık ve presipitasyon: Saf olmayan suyun kullanılması, temiz olmayan cam malzemenin kullanılması, hatalı pH, aşırı ısıtma, fomülasyondan hazırlanmış besiyerlerinde temel bileşen(ler)’in yeterli saflıkta olmaması, hazırlanmış besiyerinde depolama sırasında nem kaybı, dehidre besiyerinin çok eski olması. CaCO₃ içeren besiyerlerinde presipitasyon normaldir.

            Zayıf jelleşme stabilitesi: Hatalı tartım, dehidre besiyerinin tam çözülmemiş olması, düşük pH, aşırı ısıtma.

            Zayıf gelişme: Yetersiz yıkanmış ve/veya durulanmamış cam malzemeden inhibitör madde kontaminasyonu, hatalı pH, besiyeri katkılarının hatalı tartımı ve/veya ilavesi, aşırı ısıtma, dehidre besiyerinin çok eski olması, hatalı tartım.

            Aşırı gelişme: Selektif inhibitörlerin bozulacağı kadar aşırı ısıtma veya selektif katkıların yüksek sıcaklıkta bazal besiyerine ilavesi, selektif inhibitörlerin eksik tartımı/ilavesi.

            Kolonilerin yayılması: Besiyeri yüzeyinin çok ıslak olması, selektif inhibitörlerin bozulacağı kadar yüksek ısı.

            Atipik gelişme: Besiyerinin hatalı hazırlanması, dehidre besiyerinin çok eski olması, hazırlanmış besiyerinin uygun olmayan koşullarda ve/veya uzun süreli depolanması, cam malzeme ve/veya sudan çeşitli inhibitörler ve/veya yabancı maddelerin kontaminasyonu.

            Mikroorganizmaların beklenmeyen şekillerde (zayıf, çok kuvvetli, atipik, yayılmış koloni) gelişmesi besiyeri hatalarından gelebileceği gibi materyal ve/veya geliştirme hatalarından da kaynaklanabilir. Örneğin materyalde inhibitör madde varsa ve materyal doğrudan besiyerine ekiliyor ile gelişme zayıf olacaktır.

6.3. Besiyerinin Kalite Kontrolü

            Besiyeri üreten firmalar, ürettikleri ve pazarladıkları dehidre besiyerleri, hazır besiyerleri, besiyeri katkılarını sistematik kalite kontrolden geçirmektedirler.

            Bu ürünleri kullananlar için ise ilave kontrol uygulamalarına genellikle gerek duyulmaz. Bununla beraber aşağıdaki kontrollerin kullanıcılar tarafından yapılması yararlı olacaktır.

            – Laboratuvarda sık kullanılan dehidre besiyerleri için, halen kullanılmakta olan kutudan son parti besiyeri hazırlanırken yeni kutunun açılması, bu kutudan da yeteri miktarda besiyeri hazırlanması, ekimlerin her iki grup besiyerinde beraberce (paralel) yapılması ile bir anlamda yeni kutu için kalite kontrol yapılmış olur. Her iki grupta, istatistik olarak analiz yapılmak üzere birbirlerinden farksız sonuç alınması gerekir. Yeni açılan kutuda daha yüksek gelişme elde edildi ise ve eski kutu çok uzun bir süreden beri kullanılıyor ise farklılık normal kabul edilmelidir. Ancak hiç bir koşulda yeni kutu ile elde edilen sonuçlar eski kutudakilerden daha az olmamalıdır.

            – Aynı uygulama besiyeri katkıları için de yapılmalıdır.

            – Besiyeri üreten firmalar tarafından hazırlanan kataloglarda hangi besiyerinde hangi mikroorganizmaların nasıl gelişebilecekleri "kalite kontrol mikroorganizmaları" olarak gösterilir. Bu mikroorganizmaları besiyeri üreten firmalardan sağlamak oldukça yüksek maliyetleri gerektirir. Özel mikroorganizmalar ile çalışan laboratuvarlarda belirli bir kültür kolleksiyonu oluşturmak ve kalite kontrol için bunları kullanmak çoğu kez tatmin edici sonuç verebilir.

            – Besiyerinde, kullanıcı tarafından çözülemeyen bir hata kaynağı ve/veya kalite kontrol sorunu varsa, önce besiyerini pazarlayan firmayla temas kurulmalıdır.

6.4. Yıkama

            Çalışmanın son aşaması kullanımı biten besiyerlerinin atılması/dökülmesi ve cam malzemenin yıkanarak yeniden kullanıma hazır hale getirilmesidir.

            Plastik (disposal) petri kutuları ile çalışıldığında bu malzemenin tekrar kullanımı söz konusu değildir. Cam malzeme ise tekrar kullanılır.

            Bu aşamada en önemli husus çalışılan mikroorganizmanın niteliğine göre atma/dökme/yıkama öncesi sterilizasyon işlemidir.

            Genel bir prensip olarak çalışmanın bitiminde tüm malzemenin sterilize edilip, sonra atılması/dökülmesi/yıkanması gerekir. Laktik starter kültürleri gibi zaten peynir, yoğurt gibi gıdalar ile milyonlarcası doğrudan tüketilen bakteriler için sterilizasyon yapmak gerekmeyebilir. Bununla beraber, laboratuvar disiplini açısından "ekim yapılmış ancak herhangi bir mikroorganizma gelişmemiş" besiyerlerinin dahi sterilize edildikten sonra atılması/dökülmesi/yıkanması gerekir. Genel bir kural olarak, sadece ekim yapılmamış olan besiyerleri doğrudan atılabilir/dökülebilir/yıkanabilir.

            Atma/dökme/yıkama öncesi sterilizasyon işlemi patojenler ile çalışıldığında çok daha önemlidir. Rutin kontrollerde genel besiyerlerinde gelişen mikroorganizmaların içinde patojenler de olabileceği için, bunlar da patojen ile çalışılmış gibi düşünülmelidir.

            Atma/dökme/yıkama öncesi sterilizasyon işleminin genel olarak otoklavda yapılması önerilir. Burada uygulanacak sterilizasyon normu 121^oC’da 30 dakika olarak verilmektedir. Otoklavda sterilizasyon 3 açıdan sıkıntı oluşturmaktadır.

            – Sterilizasyon normu, besiyeri sterilizasyon normundan süre olarak daha uzundur. Bu durumda otoklavın kullanılmış malzemenin sterilizasyonu için tekrar çalıştırılması gerekir. Yoğun çalışan ancak sadece 1 otoklavı olan laboratuvarlar için bu durum sorun yaratmakta, dolayısıyla bu tip laboratuvarlarda kullanılmış besiyerlerini hazırlanan besiyerleri ile birlikte sterilize etmek yoluna gidilmektedir. Bu aşamada, Uluslararası Standartlar Enstitüsü (ISO) tarafından "işi bitmiş malzeme ile yeni hazırlanmakta olan besiyerlerinin sterilizasyonu için aynı otoklavın kullanılmaması, laboratuvarda bu 2 uygulama için 2 ayrı otoklav bulunması gerektiğini" bildirilmesi gözden uzak tutulmamalı, bu gibi bilgilerin abartılmış detay değil, belirli bilimsel temellere dayandığı unutulmamalıdır.

            – Petri kutuları düzgün yerleştirilmezse otoklavlama sırasında eriyen agar petriden sızarak otoklava dökülür ve temizlik sorunu çıkarır.

            – Besiyeri biyokimyasal testler için kullanılmış ve kültüre çeşitli kimyasallar ilave edilmiş ise bunların otoklavda sterilizasyonu bu kimyasalların buharları nedeni ile sorun çıkarmaktadır. Bu gibi durumlarda kimyasal dezenfeksiyon yoluna gidilmeli, ancak dezenfeksiyonda kullanılacak kimyasal ile kültüre ilave edilmiş kimyasalın birbirlerini olumsuz yönde etkilememelerine, özellikle ilave edilen kimyasalın dezenfektan olarak kullanılacak kimyasalın dezenfektan etkisini ortadan kaldırmamasına dikkat edilmeli, buna göre dezenfektan seçilmelidir.

            Plastik petri kutularının sterilizasyonu için bunların özel, ısıya dirençli plastik torbalara konularak otoklavlanmaları ve işlem bitince torba ile birlikte atılmaları gerekir. Plastik petri kutularının otoklavlama sıcaklığında tümüyle deforme olacağı unutulmamalıdır.

            Kimyasal dezenfeksiyonda dezenfektan etki konsantrasyon ve süre ile ilgilidir. Amaca uygun bir dezenfektanın ilavesinden sonra 1 gece beklemek çoğu kez yeterlidir. Standart bir petri kutusuna 10 mL dezenfektan ilave edilmelidir.