01. Yöntemin Prensibi Domateslerde 4-CPA kalıntı analizi yönteminin temel prensibi örneğe uygulanan ön işlemlerin ( hidroliz, ekstraksiyon, ekstraktın temizlenmesi, esterifikasyon) ardından kromotografik (GC-ECD/GC-MS) olarak kalitatif ve kantitatif analizine dayanmaktadır. 02. İzlenecek Yollar Domateslerde 4-CPA saptanabilmesi için kullanılan yöntemin kapsamını belirleyentemel basamaklar aşağıda sıralandığı gibidir. § Kalibrasyon § GC kolon performansının saptanması § Esterifikasyon § Jel kromatografik elusyon sınırlarının saptanması § Hidroliz § Ekstraksiyon § Ekstraktın temizlenmesi § Esterifikasyon § Gaz kromatografik tayin (GC-ECD) § Doğrulama (GC-MS) 03. Tanımlar 4-CPA : Ariloksialkan asit yapısına sahip olan4-klorofenoksiasetik asit (4-CPA) bitkilerde büyüme düzenleyici etkiye sahip kimyasal bir maddedir. Sentetik oksinler içinde yer alan renksiz kristal yapıda bir tozdur. Molekül ağırlığı : 186.6 Molekül formülü : C8H7ClO3 Erime noktası : 157.15 oC Çözücü : 4-CPA bir çok organik çözücüde hızla çözünmektedir. NOELdeğeri : Mevcut değil. ADI değeri : Mevcut değil. Domates yetiştiriciliğinde etkili sonuç genellikle 20-25 mg/kg konsantrasyondaki 4-CPA çözeltisinin çiçek kümeleri üzerine püskürtülmesi ile alınmaktadır. 04. Kullanılan Alet-Ekipmanve Aksesuarlar § 50 ml’likkapaklı balonlar § 25 ml’lik ölçekli deney tüpleri § Otomatik pipet § Karıştırıcı (Vorteks) § Hassas terazi § Parçalama makinesi § Çalkalamalı su banyosu § Rotary evaporatör § Jel permeation kromatografi sistemi(Kolon, kolon akış adatörü, peristaltik pompa) § GC-ECD § GC-MS 05. Kullanılan Kimyasallar § Aseton, ekstra saf, (Merck 1.00013) § Diklormetan, ekstra saf, (Merck 1.06049) § Etilasetat, ekstra saf, (Merck 1.00864) § Sikloheksan, ekstra saf, (Merck 1.02832) § n-Heksan, ekstra saf, (Merck 1.14371) § Metanol, ekstra saf, (Merck 1.06008) § Sodyum hidroksit, ekstra saf, (Merck 1.06498) § Sodyum sülfat, anhidroz, ekstra saf, (Merck 1.06643) § Sodyum klorür, ekstra saf, Merck (1.06400) § Sodyum bikarbonat, ekstra saf, (Merck 1.06323) § Sülfürik asit, %95-98, (Merck 1.00713) § Asetik asit, glacial, (Merck 1.00063) § Bio Beads S-X3, 200-400 mesh, Bio Rad no : 152-2750 § 4-CPA, standart, Dr. Ehrenstorfer, CAS no : 122-83-3, 11480000 § Su, bidistile § Su, deiyonize § 1 N NaOH çözeltisi §%20’lik H2SO4 çözeltisi § %4’lük NaHCO3 çözeltisi § Etilasetat : Sikloheksan karışımı (1:1, v/v) § Standart Çözeltiler: Stok standart çözelti hazırlanmasında çözücü olarak metanol, metil esteri formundaki satandartlar için ise aseton kullanılır. 4-CPA stok çözeltisi :10 ng/µl konsantrasyondaki standart çözelti stok çözelti olarak kullanılır.Bu çözelti metanol ile seyreltilerek 1, 2, 3, 4, 5 ve 10 ng/µl konsantrasyonlarında 4-CPA standart çözeltisi hazırlanır. 06. Deneyin Yapılışı 06.01. Metot kalibrasyonu 4-CPA analizlerinde kalibrasyon aralığı 0-10 µg/ml olarak belirlenmiştir.Bu nedenle, kalibrasyon eğrilerinin hazırlanmasında 1, 2, 3, 4, 5 ve 10 µg/ml 4-CPA konsantrasyonlarına eşdeğer olan 4-CPA ME standart çözeltileri kullanılır. Standart çözeltiler gaz kromatografik olarak analiz edilerek 4-CPA metil esterlerinin relatif ECD duyarlılıkları saptanır.Standart kalibrasyon eğrilerinin hazırlanmasında konsantrasyona (µg/ml) karşılık ECD ölçüm sonuçları (Hz) esas alınır. 06.02. Kolon Performansının Saptanması Kullanılan kapiler kolon (CP-sil8, 30 m x 0.25 mm ID), öncelikle boş enjeksiyon yapılmak suretiyle, kolondan kaynaklanabilecek olası girişimlerin belirlenmesi amacıyla test edilir. Kolon separasyon etkinliğinin test edilmesi amacıyla sırasıyla 10 ve 10 ng/µl konsantrasyonlarındaki 4-CPA’ye eşdeğer 4-CPA ME içerecek şekilde hazırlanır ve kolona enjekte edilir. Kolonda separasyonun tekrar edilebilirliğinin belirlenmesi için ise 1, 2, 3, 4 ve 5 ng/µl 4-CPA konsantrasyonlarına eşdeğer olan 4-CPA ME standart çözeltilerinden yararlanılır. 06.03. Esterifikasyon 4-CPA asit formdan ester forma dönüştürülmeleri amacıyla CH3OH/H2SO4 esterifikasyon yöntemi kullanılır. Buna göre, asit formda ve metanol içerisinde hazırlanan standart çözeltinin 2 ml’si 25 ml’likbir deney tüpüne aktarılır. Üzerine yavaş yavaş konsantre H2SO4ilave edilir ve bir dakika boyunca çalkalanır. Oda sıcaklığında, arasıra karıştırılmak suretiyle 10 dakika bekletildikten sonra esterifikasyon reaksiyonu tamamlanır. Oluşan metil esterin ekstraksiyonu amacıyla tüp içerisine 10 ml su, 2 g NaCl ve 2 ml n-heksan ilave edilir ve tüp içeriği vorteks karıştırıcı kullanılarak 2 dakika kuvvetlice çalkalanır. Fazlar ayrıldıktan sonra, üstte kalan n-heksan fazı pastör pipeti ile alınıp 2 ml’lik örnek şişesine aktarılır. Mümkünse hemen analize alınır ve/veya analiz öncesi (-18 oC)’de saklanır. 06.04. Esterifikasyonun Uygulanabilirliği Esterifikasyon yönteminin uygulananbilirliğinin test edilmesi amacıyla, 1, 2, 3, 4, 5 ve 10 ng/µl konsantrasyonlarda metanolde hazırlanmış 4-CPA çözeltilerinin esterifikasyonu gerçekleştirilerekelde edilen esterler gaz kromatografik olarak analiz edilir. Böylelikle 4-CPA için 1-10 ng/µl aralığında esterifikasyon yönteminin uygulananbilirliği kontrol edilir. 06.05. Jel Kromatografik Elusyon Sınırlarının Saptanması 06.05.01. Jel Kromatografın hazırlanması (GPC) Çalışmada, peristaltik pompa, kolon ve mobil faz rezervuarından oluşan yarı sürekli bir sistem kullanılır. Mobil faz karışımı organik çözücülerden oluştuğu için, tüm pompa aksamı , boru-bağlantı elemanları, kolon, organik çözücülere dayanıklı malzemelerden seçilmiştir. Kolon dolgu maddesi (jel) olarak Bio-Beads S-X3 kullanılmıştır.GPC operason koşulları Çizelge 1‘de verilmiştir. Çizelge 1. GPC operasyon koşulları Pompa Peristaltik pompa Kolon 1.0 cm ID X 50 cm, Bio Beads S-X3 dolgulu, 200-400 mesh, dolgu yüksekliği 32 cm Mobil Faz Etilasetat : Sikloheksan karışımı (1: 1, v / v) Akış hızı 2.0 ml / dak Enjeksiyon şekli Manuel Enjeksiyon hacmi 1 ml 06.05. 02. GPC Elusyon sınırlarının saptanması Jel kromatografik elusyon sınırlarının saptanması amacıyla 10 ng/µl konsantrasyonda metanolde hazırlanmış 4-CPA standart çözeltileri kullanılır.Öncelikle 5 ml standart çözelti bir deney tüpüne aktarılır ve metanolun tamamı azot gazı akımında uzaklaştırılır. Kalıntı 5 ml etilasetat:sikloheksan karışımı (1:1, v/v) ile tekrar çözündürülür. Bu çözelti Bio Beads S-X3dolgulu jel kolonuna enjekte edilir. Jel kromatografisi çalışma koşulları : Kolon beslemesi 2 ml/dak akış hızında etilasetat:sikloheksankarışımı (1:1, v/v) olmak üzere, eluatlar 5 ml’lik fraksiyonlar halinde, toplam hacim 100 ml olana kadar toplanır. Fraksiyonların analizleri ayrı ayrı gerçekleştirilir. Bu amaçla organik çözücünün tamamı azot gazı akımında evapore edilir ve kalıntı 2 ml metanol ile tekrar çözündürülür. Daha sonra örneğe esterifikasyon yöntemi uygulanarak esterleştirilmiş örnekler gaz kromatografik olarak analiz edilir. Domates ekstraktının Bio Beads S-X3 dolgulu kolonda jel kromatografik temizlenmesi sırasında, elusyon sınırlarında meydana gelebilecek sapmalar da ayrıca belirlenir. Bu amaçla 4-CPA kalıntısı içeren 5 ml domates ekstraktı Bio Beads S-X3 dolgulu kolona enjekte edilmiştir.Elusyon sırasında oluşan dört farklı renkteki bant (kirli sarı, turuncu, açık sarı, renksiz) ayrı ayrı toplanarak 4-CPA için analizedilir. 06.06.Numune Çalışması 06.06.01. Ön işlemler Derin dondurucudan çıkartılan domates örneği bir süre oda sıcaklığında bekledikten sonra mikserde parçalanır. Parçalanmış domates örneği oda sıcaklığına ulaşıncaya kadar bekletilir. 06.06.02. Hidroliz Domates bünyesinde serbest formda bulunan kalıntının yanısıra bağlı ve/veya konjuge formdaki kalıntının da belirlenebilmesi amacıyla alkali hidroliz yöntemi uygulanır. Bu amaçla 400 ml’lik bir behere 25 g domates tartılır ve üzerine 60 ml saf su ve 15 ml 1 N NaOH çözeltisi ilave edilir (pH > 10.0). Geri kazanma denemelerinde örneklere uygun miktarda 4-CPA ilavesi gerçekleştirilir. Örneğe ilave edilen 4-CPA miktarları ise domateslerdeki kritik kalıntı düzeyinden (0.5 mg/kg) düşük ve yüksek durumlar gözönüne alınarak 0.0 (kontrol), 0.1, 0.5 ve 1.0 ng/µl olarak belirlenmiştir. Karışım çalkamalı su banyosunda 95 0C’de 2 saat süreyle ısıtılarak hidroliz edilir. Süre sonunda örnek karışımından buharlaşma yolu ile uzaklaşan su kadar bidistile su örneğe ilave edilir. 06.06.03. Ekstraksiyon Alkali hidrolizinin ardından kalıntının ekstraksiyonu gerçekleştirilir. Buna göre hidrolizat yaklaşık 5 ml %20 H2SO4 çözeltisi ilave edilmek suretiyle asitlendirilir (pH f) %80’i 1000 ml’lik bir ayırma hunisine aktarılarak ekstraksiyonda kullanılmıştır. Bu sayede kalıntı miktarının hesaplanmasında kullanılan formüller basitleştirilmiştir. Teorik filtrat hacmi ilave edilen 200 ml aseton, 15 ml 1 N NaOH çözeltisi, yaklaşık 5 ml %20 H2SO4 çözeltisi ile örnekte doğal olarak bulunan suyun toplam hacmidir. Teorik filtrat hacminin hesaplanmasında aseton-su hacim kontraksiyonu göz önünde bulundurulmalıdır. 200 ml aseton ve 100 ml su için bu değer 5 ml’dir. Yani 200 ml aseton ile 100 ml suyun toplam hacmi 295 ml’dir. Ayırma hunisine aktarılan filtrat üzerine Vf / 10 g NaCl ilave edilmiş ve 3 dakika kuvvetlice çalkalanır. Fazların ayrılması için yaklaşık olarak 30 dakika beklenir. Alttaki sulu faz atıldıktan sonra organik faz hacmi (V0) kaydedilir ve ardından içerisinde V0 / 10 g anhidroz Na2SO4 bulunan bir erlene aktarılır. Organik faz anhidroz Na2SO4 üzerinde 20 dakika boyunca bekletilerek kurutulur. Süre sonunda organik faz siyah bant filtre kağıdı üzerinden 250 ml’lik bir Rotary balonu içerisine aktarlır. Filtre tabakası 20 ml etil asetat ile yıkanarak Rotary balonuna aktarılır. 06.06.04. Ekstraktın temizlenmesi Organik faz önce jel kromatografik, daha sonra asit-baz partitisyonu ile temizlenmelidir. Jel kromatografik temizleme amacıyla organik faz 40 0C’de Rotary evaparöterde, son hacmi yaklaşık 1 ml olacak şekilde konsantre edilir. Konsantre örnek üzerine 4.5 ml etil asetat eklenir ve hafifçe çalkalanır. Üzerine 4.5 ml sikloheksan ilave edilerek hafifçe çalkalanır. Örnek toplam hacminin yaklaşık %50 si (yaklaşık 5 ml) Bio Beads S-X3 dolgulu kolonuna enjekte edilir. Kolon çıkışından alınan eluat daha önceden saptanan eluat sınırları kullanılarak toplanır. Asit-baz partitisyonu ile temizleme amacıyla jel kromatografi kolonundan toplanan eluat, 15 ml etil asetat:sikloheksan karışımı (1: 1) ile birlikte 100 ml’lik ayırma hunisine aktarılarak 2X 30 ml %4’lük NaHCO3 ile ekstrakte edilir. NaHCO3 fazları birleştitildikten sonra 3-4 ml %20’lik H2SO4 ilave edilerek asitlendirilir. Bu sırada açığa çıkanCO2, hafif karıştırmak suretiyle uzaklaştırılır. Asitlendirilmiş NaHCO3 fazları 3 x 20 ml diklormetan ile ekstrakte edilir ve diklormetan fazları birleştirilir. 06.06.05. Esterifikasyon Diklormetan ekstraktı, üzeri 1 cm Na2SO4 kaplı siyah bant filtre kağıdı üzerinden filtre edilir ve filtre tabakası 2-3 ml diklormetan ile yıkanır. Diklormetanın tamamı 40 0C’de Rotary evaparatör yardımıyla buharlaştırılır. Kalıntı azot gazı akımında tamamen kurutulur ve kurutulmuş kalıntı 2 ml metanol ilave edilerek tekrar çözündürülür. Bundan sonra, asit formda ve metanol içerisinde hazırlanmış standart çözeltinin tamamı 25 ml’likbir deney tüpüne aktarılır. Üzerine yavaş yavaş konsantre H2SO4ilave edilir ve bir dakika boyunca çalkalanır. Oda sıcaklığında, arasıra karıştırılmak suretiyle 10 dakika bekletildikten sonra esterifikasyon reaksiyonu tamamlanır. Oluşan metil esterin ekstraksiyonu amacıyla tüp içerisine 10 ml su, 2 g NaCl ve 2 ml n-heksan ilave edilir ve tüp içeriği vorteks karıştırıcı kullanılarak 2 dakika kuvvetlice çalkalanır. Fazlar ayrıldıktan sonra, üstte kalan n-heksan fazı pastör pipeti ile alınıp 2 ml’lik örnek şişesine aktarılır. Mümkünse hemen analize alınır ve/veya analiz öncesi (-18 oC)’de saklanır. 06.07. GC-ECD ANALİZİ Hazırlanan çözeltinin analizi gaz kromatografik (GC-ECD) olarak gerçekleştirilir. Bu amaçla örneğin 1 µl’si SE-54 kapiler kolon ve/veya muadili olan bir kapiler kolona enjekte edilir. Kromatografik koşullar Çizelge 2’de verildiği gibidir. Çizelge 2. GC-ECD operasyon koşulları Gaz Kromatograf Varian 3800 serisi gaz kromatograf Dedektör ECD Kolon CPSil-8 (0.25 mm ID x 30 m, 0.25 µm film kalınlığı) Enjeksiyon bloğu Split / Splitless Sıcaklık programı 80 0C (0 dak) 80 0C 250 0C (10 0C / dak) 250 0C (3 dak) ECD sıcaklığı 300 0C Enjektör sıcaklığı 250 0C Taşıyıcı gaz Azot, %99.999 saflıkta Toplam gaz akış hızı 95 ml /dak Gaz akış hızı 2,5 ml /dak (~ 10 psi) Enjeksiyon hacmi 1 µl 06.08. DOĞRULAMA GC-ECD analizi elde edilen sonuçların kalitatif ve kantitatif doğrulaması GC-MSkullanılarak gerçekleştirilir. Buna göre GC-ECD analizi yapılan örneklerin her biri GC-MS kullanılarak analiz edilir. Bu amaçla Agilent 6890 model bir gaz kromatograf,Agilent 5937 model kütle seçici dedektör, Agilent 7683 model otoenjektör-otoörnekliyici entegre sistemi kullnılmaktadır. GC-MS performansının optimizasyonu amacıyla 170 0C’de ototonlama işlemi gerçekleştirilir. Bu amaçla pentaflorotributilamine ait iyonlar (m/z 69, 219, 502) kullanılır.GC-MS operasyon koşulları Çizelge 3’de verilmiştir. Çizelge 3. GC-MS operasyon koşulları Gaz Kromatograf Agilent 6890 serisi gaz kromatograf Dedektör Agilent 5973 Kütle selektif dedektör Kolon HP-5 (0.25 mm ID x 30 m, 0.25 µm film kalınlığı) Enjeksiyon bloğu Splitless Sıcaklık programı 80 0C (0 dak) 80 0C 250 0C (10 0C / dak) 250 0C (3 dak) Dedektör sıcaklığı 300 0C Enjektör sıcaklığı 250 0C Taşıyıcı gaz He Toplam gaz akış hızı 95 ml /dak Gaz akış hızı 2,5 ml /dak (~ 10 psi) Enjeksiyon hacmi 1 µl İyonizasyon potansiyeli 70 eV 07. Hesaplamalar Domatesdeki4-CPA kalıntı miktarı mg/kg olarak ifade edilir. Hesaplanan kalıntı düzeyleri, ortalama geri kazanma oranları göz önüne alınarak düzeltilir. Hesaplamada kullanılan eşitlik aşağıdaki gibidir : (a) Test çözeltisindeki kalıntı konsantrasyonunun hesaplanması Ct = CS x At / AS veya Ct = At –b / a Burada ; Ct = Test çözeltisindeki kalıntının konsantrasyonu, µg/ml CS = Standart çözeltinin konsantrasyonu, µg/ml At = Test çözeltisi içindeki kalıntının pik alanı, AS = Standart çözeltinin pik alanı, a = Standart eğrinin eğimi b = Kalibrasyon eğrisinin y-eksenini kestiği nokta (b) Domatesteki kalıntı miktarının hesaplanması Kalıntı (ppm) = Ct x Vt / m Burada ; Ct = Test çözeltisi içerisindeki kalıntının konsantrasyonu, µg/ml Vt = Test çözeltisinin hacmi, ml m = Test çözeltisinin temsil ettiği örnek miktarı, g (c) Düzeltilmiş kalıntı miktarının hesaplanması Düzeltilmiş kalıntı (ppm) = (Kalıntı (ppm) / R ) x 100 Burada ; R = Geri kazanma oranı, % 08. GÜVENLİK VE SAĞLIK UYARILARI Çalışma yönteminin doğru olarak, eksiksiz ve modifiye edilmeden takip edilmesi çalışma güvenliği açısından zorunludur. Bu yöntemde kullanılan her bir kimyasal ait toksik ve/veya karsinojenik etki tek tek açıklanmamakla birlikte her kimyasal maddenin potansiyel sağlık riski taşıdığı bilinerek hareket edilmelidir. Bu nedenle çalışma sırasında oldukça dikkatli olunmalıdır : § Çalışanlar eldiven takmalıdır. § Çalışmanın tamamı çeker ocak altında yürütülmelidir. § Kullanılan bütün kimyasallar kesinlikle deri ile temas ettirilmemeli ve solunmamalıdır. 09. DİKKAT EDİLMESİ GEREKEN NOKTALAR Çalışma sırasında oluşacak interferanslar kullanılan solventlerde, cam malzemelerde ve diğer örnek hazırlama ve/veya ön işlemlere ait aparatlarda kontaminasyona neden olabilir.Bu nedenle her analizde mutlaka yalnızca çözücünün kullanıldığı bir kör ile okuma yapılmalıdır.Ayrıca dikkat edilmesi gerekennoktalar aşağıda verilmiştir : § Cam malzeme mutlaka asitten geçirilmeli, su ile temizlenmeli ve distile sudan geçirildikten sonra kurutularak kullanılmalıdır. § Yüksek saflıkta reagent ve solvent kullanımı interferansları minimize edebilir. § Okumalar sırasında kolonda kalan kirlilik faktörleri nedeniyle oluşacak interferansların giderilmesi için boş okumaların yapılması gereklidir. § Standart okumaları sırasında düşük konsantrasyondan yüksek konsantrasyona doğru okuma yapılmalıdır. § Jel kromotografidüzeneği kurulması aşamasında mobil faz karışımı organik çözücülerden oluştuğu için, tüm pompa aksamı , boru-bağlantı elemanları, kolon, organik çözücülere dayanıklı malzemelerden seçilmelidir. belgesi-1767