Amino asit Tanıma Reaksiyonları

Categories: Biyokimya

AMİNO ASİT TANIMA REAKSİYONLARI

Doğada 300’den fazla amino asit tanımlanmış olmasına rağmen memelilerde bunlardan yalnızca 20 tanesi proteinlerin yapısında yer almaktadır. Amino asitler prolin dışında aynı karbon üzerinde amino (-NH₂) ve karboksil (-COOH) grubu bulundururlar. Prolin ise siklik bir yapıya sahiptir ve amino grubu yerine imino grubu taşır. Amino asitlerin genel gösterimleri R-CH-NH₂-COOH şeklindedir. R grubu değişken gruptur. R grubunun değişmesiyle 20 çeşit primer veya standart amino asit meydana gelir. Bu 20 çeşit amino asitin değişik sayı ve sıra ile dizilimi çok sayıda proteinin ortaya çıkmasına yol açar.

Glisin dışındaki tüm amino asitlerin en az bir tane asimetrik karbonu vardır ve optik olarak aktiftirler. Bunlar da D ve L olarak iki ayrı konfigürasyonda olabilirler. Ancak proteinlerin yapısında bulunan tüm amino asitler L konfigürasyonundadırlar. D amino asitler ise bazı antibiyotiklerde ve bakteriyel hücre duvarında bulunurlar.

Amino asitler amfoterik moleküllerdir. Yani hem asidik hem de bazik gruplar içerirler. Monoaminomonokarboksilik asitler sulu çözeltilerde dipolar çözeltiler yani zwitterion şeklinde bulunurlar. a-karboksil grubu dissosiye ve negatif yüklüdür, a-amino grubu protonlanmış ve pozitif yüklüdür, yani molekül nötrdür. Asidik pH’da karboksil grubu bir proton alır ve molekülün net yükü pozitif olur. Bazik pH’da ise amino grubu proton kaybeder ve net yük negatif olur. Bir amino asidin net yükünün sıfır olduğu pH’a izoelektrik nokta denir.

Amino asitler renksiz, suda tamamen, etil alkolde ise kısmen çözünmelerine karşılık, eterde hiç çözünme özellikleri olmayan organik bileşiklerdir. Amino asit çözeltilerinin görünür bölgede ışık absorblama özellikleri yoktur. Ancak UV bölgede (280 nm’de) tirozin, triptofan, fenilalanin ve histidin gibi halkalı yapıya sahip amino asitlerin ışık absorblama yetenekleri vardır. Bu özellik biyolojik sıvılardaki protein miktarının belirlenmesinde zaman zaman faydalanılabilen bir özelliktir.

Amino amino asitler, bulundurduğu karboksil ve amino grupları, reaksiyon gücü oldukça yüksek fonksiyonel gruplar oldukları için bu grupların verdiği bütün reaksiyonları verirler. Amino asitlerin verdiği bu reaksiyonlar gerek biyolojik sıvılardaki serbest amino asitlerin cinsi ve miktarı, gerekse protein yapısına giren amino asitlerin miktarı, cinsi ve sırasını tespit etmede son derece önemlidir.

I. Amino Asit Tayininin Klinik Önemi

Dolaşımdaki amino asitler böbrekte glomerüler membranlar tarafından filtre edilirler. Bu filtrattaki amino asit konsantrasyonu plazmadakine yakındır. Ancak filtrattaki amino asitlerin büyük bir kısmı tübüler sistemde özel transport sistemleri ile geri emilip dolaşıma verilirler. Çok az bir kısmı ise idrarla atılır. Normal yetişkin bir kişinin 24 saatlik idrar amino asit düzeyi 50-200 mg arasında değişir. Bu değişimde etkili faktör diyettin tabiatıdır.

Kan amino asit seviyeleri yükseldiği zaman idrarla amino asit atılımında artış meydana gelir. Bu duruma aminoasidüri denir.

İki tip aminoasidüriden bahsedilebilir.

1) 1) Taşma tipi (overflow tipi) :

Amino asit metabolizmasında rol oynayan enzimlerin eksik veya hatalı olması sonucu görülür. Böbrek eşik düzeylerinin aşılması sebebiyle böbrekler normal çalıştığı halde böbreğin reabsorbsiyon kapasitesi aşıldığından idrar amino asit düzeyi artar. Fenilketonüri, tirozinozis, alkaptonüri ve akçaağaç şurubu idrar hastalığı buna örnektir.

2) Renal tip:

Böbrek tubuluslarındaki bozukluk sonucu oluşan aminoasidüri türüdür. Bunu sebebi konjenital veya akkiz olabileceği gibi ağır metal zehirlenmeleri, fenol zehirlenmesi veya yanıklar da olabilir. Fankoni sendromu, sistinozis, Wilson hastalığı ve nefrotik sendrom gibi.

II. Amino Asitlerin Kalitatif ve Kantitatif Tayininde Kullanılan Metotlar

Proteinlerin amino asit kompozisyonunu tespit belirlemek için kullanılan metotlar üç basamakta toplanır:

1. 1. Proteinlerin amino asitlerine hidrolizi (6N HCl, +110^oC’de 24 saat ısıtma)

2. 2. Karışımdaki amino asitlerin ayırımı

3. 3. Her bir amino asidin miktarının belirlenmesi

a) a) Ninhidrin Reaksiyonu

α-amino grubunun en karakteristik reaksiyonu olan ninhidrin reaksiyonu amino asitlerin hem kalitatif hem de kantitatif tayininde sıklıkla kullanılan bir reaksiyondur. Bütün α-amino asitler ve peptidler bu renk reaksiyonunu verirler. Ancak bazı amino asitler mavi kompleks yerine değişik renklerle ortaya çıkarlar. Örneğin, prolin ve hidroksiprolin sarı, asparagin ise kahverengi renk oluşturur. Diğer amino asitler ise mavinin değişik tonları şeklinde kompleksler oluştururlar.

b) b) Gazometrik Ölçüm

Amino asitlerin α-amino grubu HNO₂ (nitröz asit) ile reaksiyona girdiği zaman karboksilli asitlerin hidroksi türevlerini meydana getirir. Bu reaksiyon sırasında açığa çıkan N₂ gazometrik olarak ölçülür.

c) c) Kromatografik Yöntemler

Amino asitleri ve peptidleri ayırmada kullanılan değişik kromatografik yöntemler vardır. Bunlar arasında kağıt kromatografisi, ince tabaka kromatografisi, iyon değiştirme kromatografisi, gaz kromatografisi ve yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) en sık kullanılanlardır.

d) d) Elektroforetik Yöntemler

Yüksek elektrikli bir ortamda amino asitlerin yük ve büyüklük farklılıklarından faydalanılarak ayrılması tekniğidir.

e) e) Amino Asit Sırası Tayinine Yönelik Yöntemler

Peptid ve proteinlerin sırasının belirlenmesi birçok genetik kusurun ortaya çıkarılmasında faydalı olacaktır. Bir proteindeki amino asit sırasını belirlemek için N-terminal ya da C-terminal amino asit rezidülerine spesifik reaksiyonlar kullanılır.

· · N-terminal amino asitlerin belirlenmesinde kullanılan yöntemler.

Sanger Yöntemi

Alkali ortamda bir polipeptidin N-terminal amino asidinin amino grubu ile 2,4 dinitrofluorobenzen (DNF) reaksiyona girerek sarı renkli 2,4-dinitrofenol türevlerini meydana getirirler. Bu türevler elde mevcut olan amino asitlerin aynı reaktifle reaksiyona sokulmasıyla hazırlanmış olan standartları ile kağıt kromatografisi işlemine tabi tutulur. Kromatografi kağıdında elde edilen lekeler değerlendirilerek amino asidin cinsi tespit edilir.

Dansil Klorür Yöntemi

Bir polipeptidin N-terminal aminosidinin amino grubu ile floresans bir madde olan dansil klorür yüksek pH’da reaksiyona girer. Böylece dansil klorür ile işaretlenen amino asit florometrik olarak ölçülür. Bu metodla amino asit türevlerinin düşük miktarları (1 nM) bile belirlenir.

Edman Yöntemi

En önemli ve en çok kullanılan metoddur. Edman reaksiyonuyla sadece N-terminal ucu tanınmaz aynı zamanda bu reaksiyonun tekrarlanması ile uzun polipeptidlerin amino asit sırası tam olarak tespit edilir. Fenilizotiyosiyanat alkali ortamda peptidin N-terminal amino grubu ile reaksiyona girerek N-terminal amino asidin fenilizotiyosiyanat türevi oluşur. Sanger ve dansil klorür yöntemlerinden farklı olarak polipeptid parçalanmaz, sadece bir amino asit eksik polipeptid kalır. Daha sonra oluşan bu türev gaz kromotografisi ile tespit edilir.

· · C-terminal amino asitlerinin belirlenmesinde kullanılan metodlar

Polipeptidin C-terminal kalıntılarını tespit etmek için kullanılan metodlar N-terminali tespit etmek için kullanılanlar kadar kesin sonuç vermezler. Ancak bu amaç için kullanılan iki metod vardır.

Hidrazinle parçalanma (Hidrazinoliz)

Bu reaksiyon sırasında hidrazin ile C terminalindeki aminoasitler ayrılır.

Karboksi peptidazla parçalanma

Protein parçalayıcı bir enzim olan karboksipeptidaz bir proteindeki en son peptid bağına (C-terminal) etki ederek C-terminal amino asidinin koparılmasını sağlar. Elde edilen serbest amino asit, amino asitlere spesifik reaksiyonlarla tespit edilir. Bu işleme devam edilerek her defasında yeni bir C-terminal amino asit belirlenebilir.

III. Kalitatif Amino Asit Tayin Yöntemleri

Kalitatif amino asit tayini kan ve idrar örneklerinde yapılabilir. İdrar örnekleri günün herhangi bir saatinde alınan (rastgele) idrar örneği olabileceği gibi 24 saatlik idrar da olabilir.

Hücre içi amino asit seviyesi kan dolaşımından (plazma) 10 kat daha yüksektir. Kan örneği alınırken bu özellik dikkate alınmalıdır. Amino asit seviyesine plazmada bakılır. Kan heparinize enjektörle alınmalıdır. Hemolizden sakınılmalıdır.

Yapılacak Deneyler

Fenil Pirüvik Asit Deneyi

4 ml idrar üzerine 1 ml magnezyum ayıracı (11 gr MgCl₂, 14 gr NH₄Cl ve 20 ml der-NH₄OH/litre) konarak 5 dakika bekletilir, süzülür. Süzüntü 2 damla % 10’luk HCl ile asidik hale getirilir. 2 damla % 10’luk FeCl₃ ilave edilir. Mavi-yeşil renk oluşursa deney pozitifdir. Fenilketonüride sıklıkla kullanılmaktadır.

Triptofan Deneyi

2 ml örnek üzerine 2 ml derişik CH₃COOH ilave edilir. Bu karışımın üzerine damla damla tabaka oluşturacak şekilde tüp cidarından derişik H₂SO₄ sızdırılır. İki sıvının birleşme yerinde mor halkanın oluşumu örnekte triptofan bulunduğunu (pozitif reaksiyon) gösterir. (örnek: Hartnup hastalığı)

Ninhidrin Deneyi

a) Deneyin Prensibi

Bu deneyde normalde sarı olan ninhidrin, amino asitlerle reaksiyona girerek mavi-menekşe rengine dönüşür ve bu metot bu renk oluşumunun tespitine dayanır.

Bu reaksiyon sırasında 1. basamakta ninhidrin ile amino asit reaksiyona girerek amino asitten bir karbon eksik bir aldehit, redükte ninhidrin, NH₃ ve CO₂ meydana gelir. İkinci aşamada açığa çıkan NH_3,bir mol okside ninhidrinle bir mol redükte ninhidrin arasında köprü kurarak mavi-mor renkli kompleks oluşturur.

Ninhidrin NH₂-C-COOH’daki serbest a-amino grubu ile reaksiyona girer. Bu grup tüm amino asitlerde, polipeptidlerde ya da proteinlerde bulunmaktadır. Dekarboksilasyon reaksiyonu serbest amino asitlerde meydana gelmekte iken, peptidlerde ve proteinlerde meydana gelmemektedir. Böylelikle teorik olarak yalnızca amino asitler renk değişimine neden olurlar. Ancak peptidler ya da proteinler her zaman için interferansa yol açabilirler.

b) Reaktifler ve Malzemeler

A. Malzemeler

B. Reaktifler

® Test tüpleri

® Ninhidrin Solüsyonu

® Pipetler

° Ninhidrin: 0.35 g

® Ocak

° 100 ml etanol

® Spektrofotometre

c) Deneyin Yapılışı

1. 1. 1 ml ninhidrin solüsyonu (0.35 g ninhidrinin 100 ml etanole tamamlanması ile hazırlanır.) 5 ml numuneye (plazma) eklenir. Test tüpünün ağzı parafilm ile kapatılır. ( buharlaşmadan dolayı meydana gelebilecek kayıpları önlemek için)

2. 2. Hafifçe karıştırılarak 4-7 dakika süreyle kaynatma işlemine tabi tutulur.

3. 3. Daha sonra soğuk su altında tutularak oda ısısına kadar soğutulur.

Not: Isopropanol ya da 1/1 aseton/butanol karışımı ninhidrin solüsyonunun hazırlanmasında etanol yerine kullanılabilir.

belgesi-483